Příprava konstruktů pro izolaci proteinů a jejich testování

Abstract

Tato práce je zaměřená na popis produkce rekombinantních proteinu. Pro studium dané problematiky byl zvolen protein p53, který je jedním z hlavních nádorových supresorových proteinu. Protein p53 je zodpovědný za regulaci mnoha genů, které mohou kontrolovat buněčný cyklus a replikaci DNA, a je nejčastěji mutovaným genem u nádorových onemocněni člověka. Pro danou prací byly zvolený různé varianty bodových mutaci proteinů p53, které mohou ovlivnit jeho vazebné vlastnosti a funkce. Znalosti mechanizmu působení mutovaných p53 proteinů v buňce je důležité pro efektivní léčbu rakoviny. V teoretické části jsou popsaný vlastnosti proteinu a jednotlivé expresní systémy, metody Gateway klonováni, a metody použité při purifikaci a izolaci proteinů (afinitní chromatografie, SDS-PAGE analýza a Western blot analýza). V experimentální časti jsou popsané postupy přípravy expresních vektoru pomoci Gateway technologie, transformace do buněk a izolace plazmidové DNA. Klonováním byly připraveny tři expresních klony a po jejich transformace do kompetentních buněk byla provedena izolace DNA.This study is focused on describing of recombinant protein production. Protein p53 was chosen, as one of the most important tumor suppressor proteins, for studying this issue. The p53 protein is responsible for the gene regulation, control of cell cycle and DNA replication. P53 is the most mutated gene in human cancer. Several point mutations of p53 protein was chosen for work with. The theoretical part describes main properties of protein, expression systems, Gateway cloning system and methods of protein purification. In the experimental part are described the procedures of preparing of the expression vectors by Gateway technology, cell transformation and DNA plasmid isolation. Using cloning technology were prepared three expression clones, they were transformed into competent cells and after was done DNA isolation.