Využití techniky AFM při studiu biologických vzorků

Abstract

Předmětem bakalářské práce bylo studium Gram-negativních bakterií se schopností akumulovat polyhydroxyalkanoáty pomocí mikroskopie atomárních sil. V rámci experimentální části práce byly zkoumány bakteriální kmeny Cupriavidus necator H16 a jeho mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4, Rhodospirillum rubrum a Halomonas halophila. Konkrétním cílem bylo optimalizovat tuto mikroskopickou metodu pro výzkum jak bakterií na vzduchu, tak živých bakterií v jejich přirozeném prostředí. Optimalizace byla provedena s ohledem na jednoduchost, časovou náročnost a reprodukovatelnost provedení měření. Pro měření na vzduchu byla zvolena imobilizace 10× zředěné bakteriální suspenze vysušením na skleněném substrátu. Skenování bylo provedeno pomocí hrotu TESPA-V2 se sníženou konstantou tuhosti v QITM módu. V rámci měření bakteriálních vzorků v kapalině byly zkoumány různé postupy imobilizace bakterií na skleněném substrátu pomocí Poly-L-lysinu a Poly(ethyleniminu). Jako nejvhodnější fixace byla zvolena metoda s využitím Poly-L-lysinu. Pro měření v QITM módu v kapalném prostředí byly voleny hroty MLCT – A nebo SNL – B s konstantou tuhosti okolo 0,1 N/m. Nakonec byl proveden pokus o zisk informací o adhezi a Youngově modulu vysušených i živých bakterií s ohledem na předpokládané ovlivnění mechanických vlastností buněk s rozdílným obsahem polyhydroxybutyrátu u bakteriálních kmenů Cupriavidus necator H16 a Cupriavidus necator PHB-4.

The purpose of this bachelor thesis was to study Gram-negative bacteria with the ability to accumulate polyhydroxyalkanoates using atomic force microscopy. During the experimental part were studied bacterial strains Cupriavidus necator H16 and its mutant strain Cupriavidus necator PHB-4, Rhodospirillum rubrum, and Halomonas halophila. The main aim was to optimise this microscopy method to study either bacteria in the air or bacteria in liquid medium under physiological conditions. The optimisation was done considering the procedure's simplicity, time demands, and reproducibility. 10× diluted bacterial suspense was dried on a glass surface for measurements in the air. Scanning was performed using TESPA-V2 tip with lowered Spring constant in QITM mode. Various procedures for immobilising bacteria on a glass substrate using Poly-L-lysine and Poly(ethyleneimine) were tested for measurements in liquid. The method using Poly-L-lysine was chosen as the most sufficient way of immobilisation. The tips MLCT – A or SNL – B with the spring constant around 0,1 N/m were applied for measurements in liquid using QITM mode. Finally, an attempt was made to obtain information about the adhesion and Young's modulus of dried and live bacteria concerning the high difference of polyhydroxybutyrate content between the bacterial strains Cupriavidus necator H16 and Cupriavidus necator PHB-4.