Studium metabolických vlastností a stresové robustnosti vybraných kmenů Caldimonas thermodepolymerans

Abstract

Tato diplomová práce je zaměřena na zkoumání vlivu rozdílných stresových faktorů na vybrané kmeny bakterie Caldimonas thermodepolymerans, která je schopná produkce polyhydroxyalkanoátů, konkrétně ve formě polyhydroxybutyrátu. Vybranými stresovými faktory byly teplotní šok ve formě vysoké i nízké teploty a opakované cykly zmrazování a rozmrazování. Současně byla provedena charakterizace růstových a metabolických vlastností vybraných kmenů C. thermodepolymerans za různých neoptimálních podmínek růstu. V experimentální části byly porovnány tři kmeny termofilní bakterie Caldimonas thermodepolymerans, divoký kmen DSM 15344 a dva geneticky upravené kmeny: phaC, který je v důsledku delece genu pro PHA syntázu neschopný produkce polyhydroxyalkanoátů, a phaZ, postrádající schopnost degradace PHA z důvodu odstranění genu pro intracelulární PHA depolymerázu. V první sérii testů byla odolnost jednotlivých kmenů vůči akutním stresovým podmínkám hodnocena stanovením viability metodou průtokové cytometrie po krátkodobé expozici extrémním teplotám a opakovaným mrazicím cyklům. V navazující sérii experimentů byly sledovány růstové charakteristiky kmenů za mírnějších stresových podmínek, konkrétně při rozdílných teplotách kultivace v produkčním a nutrient broth médiu. V rámci těchto experimentů byl měřen nárůst optické hustoty kultivací a obsah PHB v biomase byl analyzován pomocí plynové chromatografie s plamenově ionizační detekcí (GC-FID). Výsledky ukázaly, že mutantní kmen phaZ vykazoval nejlepší růst a odolnost při mírném osmotickém stresu a nízké teplotě, ale byl nejcitlivější na opakované mrazicí cykly. Kmen phaC byl nejodolnější vůči zmrazování, avšak rostl nejslaběji a až na jednu výjimku neakumuloval PHB. Divoký kmen byl nejcitlivější na teplotní šok, a to jak ve formě vysoké, tak nízké teploty, přesto však dosahoval stabilního růstu a vysokého obsahu PHB, zejména v produkčním médiu.This diploma thesis focuses on investigating the effects of different stress factors on selected strains of the bacterium Caldimonas thermodepolymerans, which is as wild-type strain capable of producing polyhydroxyalkanoates, specifically in the form of poly-3-hydroxybutyrate. The chosen stress factors were thermal shock and repeated freezing and thawing cycles. Additionally, the growth and metabolic characteristics of selected C. thermodepolymerans strains under various growth conditions were characterised. In the experimental part, three strains of the thermophilic bacterium Caldimonas thermodepolymerans were compared: the WT-type strain DSM 15344 and two genetically modified strains: phaC, which, due to the deletion of the gene for PHA synthase, is incapable of producing polyhydroxyalkanoates, and phaZ, which lacks the ability to degrade PHA as a result of the deletion of the gene for intracellular PHA depolymerase. In the first series of tests, the resistance of individual strains to acute stress conditions was assessed by determining cell viability using flow cytometry after short-term exposure to extreme temperatures and repeated freeze–thaw cycles. In the subsequent series of experiments, the growth characteristics of the strains were investigated under milder stress conditions, specifically at different cultivation temperatures in production and nutrient broth media. During these experiments, the increase in optical density of the cultures was measured, and the PHB content in biomass was analysed using gas chromatography with flame ionisation detection (GC-FID). The results showed that the mutant strain phaZ demonstrated the best growth and tolerance under mild osmotic stress and low temperatures, but was the most sensitive to repeated freeze–thaw cycles. The phaC strain was the most resistant to freezing, but exhibited the weakest growth and, with one exception, did not accumulate PHB. The wild-type strain was the most sensitive to temperature shock, both in the form of high and low temperature exposure; nevertheless, it displayed stable growth and a high PHB content, particularly in the production medium.