Izolace a charakterizace protilátek specifických k DNA struktuře kvadruplexu

Abstract

Tato bakalářská práce se věnuje izolaci tří protilátek vázajících guaninové kvadruplexy (G-kvadruplexy) a jejich charakterizaci prostřednictvím SDS-PAGE, westernového přenosu s následnou imunodetekcí a elektroforetických testů posunu mobility k vyhodnocení specifity vazby ke kvadruplexové DNA. G kvadruplexy jsou nekanonické sekundární struktury DNA vznikající v oblastech bohatých na guanin, jako jsou například telomery, či promotory některých onkogenů, kde plní regulační funkce a mohou se podílet na vzniku nádorových onemocnění. V první části této práce byly protilátky BG4, SG4 a její mutant SG4 R105A izolovány z bakteriálního expresního systému E. coli BL21 DE3, načež byla stanovena jejich koncentrace v získaných kontrolách a elucích metodou podle Bradfordové. Čistota získaných elucí byla potvrzena SDS-PAGE a westernovým přenosem s následnou imunodetekcí. V druhé části této práce byly vazebné vlastnosti izolovaných proteinů analyzovány metodou elektroforetických testů posunu mobility. Výsledky vazebných experimentů prokázaly vysokou specifitu proteinu SG4 ke G-kvadruplexům, obzvláště v nízkých molárních poměrech DNA:protein (1:5). Oproti tomu protilátka BG4 vykazovala horší specifitu vůči G-kvadruplexové DNA. Při vyšších koncentracích protein BG4 vykazoval stejnou preferenci vazby ke dvouřetezcové DNA jako ke struktuře G-kvadruplexu. Rozdíl afinity BG4 ke G-kvadruplexové a dvouřetězcové DNA se pohyboval v rámci stanovené experimentální chyby. Protilátka SG4 R105, která byla vytvořena jako mutantní protein SG4 bez preference k vazbě G-kvadruplexů překvapivě vázala jednořetězcovou i G-kvadruplexovou DNA.The aim of present bachelor thesis has been to isolate guanine quadruplex (G-quadruplex) binding antibodies and characterise them by the means of SDS-PAGE, western blot and immunostaining with a subsequent evaluation of their binding capabilities using an electrophoretic mobility shift assay. G quadruplexes are non-canonical secondary DNA structures formed by guanine rich sequences. They are commonly found in telomeres or oncogene promoters where they fulfil important regulatory functions and contribute to the onset of some tumours. The first part of this thesis is dedicated to the isolation process of BG4, SG4 and SG4 R105A antibodies from the E. coli BL21 DE3 expression system, their determination using the Bradford protein assay followed by the aforementioned western blot and immunostaining, confirming their purity. Their binding capabilities have been assessed using the electrophoretic mobility shift assay in the second part. On the one hand, SG4 has been found to bind G-quadruplexes with high specificity especially in lower DNA:protein molar ratios (1:5), which is consistent with available literature. BG4 on the other hand, has shown comparable affinity to both guanine quadruplexes and double stranded DNA. A surprising finding has been a relatively large affinity of SG4 R105A, a mutant of SG4 engineered to have a low affinity to G-quadruplexes, towards single stranded DNA. Furthermore, it’s measured affinity to G-quadruplexes has been comparable to that of BG4 in lower DNA:protein ratios.