Analýza vazby proteinu IFI16 na DNA
| but.committee | prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda) doc. Ing. Petr Sedláček, Ph.D. (místopředseda) prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D. (člen) doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen) doc. RNDr. Renata Mikulíková, Ph.D. (člen) doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen) prof. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. (člen) | cs |
| but.defence | 1. Studentka seznámila členy komise s náplní a cílem diplomové práce. 2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci. 3. Studentka akceptovala všechny připomínky oponenta a na všechny otázky odpověděla v plné šíři. Diskuse: prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. Prosím zkuste Vaši práci vysvětlit jednodušeji a srozumitelněji. Proč jste studovali tento protein a jeho vazbu na DNA? Jaký vliv má vazba proteinu na DNA? Jaký je mechanismus spouštění imunitní reakce? Jaký je závěr Vaší práce? U nádorových buněk je důležité, aby se aktivovali pro nebo proti apoptické děje? doc. Ing. Petr Sedláček, Ph.D. Jaký je mechanismus navázání proteinu na DNA? Studentka výborně odpověděla na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. V diskusi studentka prokázala výbornou orientaci v dané problematice. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Diplomantka prokázala nejen výborné odborné znalosti, ale i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků. | cs |
| but.jazyk | čeština (Czech) | |
| but.program | Chemie pro medicínské aplikace | cs |
| but.result | práce byla úspěšně obhájena | cs |
| dc.contributor.advisor | Brázda, Václav | cs |
| dc.contributor.author | Kratochvilová, Libuše | cs |
| dc.contributor.referee | Smetana, Jan | cs |
| dc.date.created | 2023 | cs |
| dc.description.abstract | Tato diplomová práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovatelného proteinu 16 (IFI16) na DNA s potenciálem tvorby G-kvadruplexu. Protein IFI16 obsahuje dvě tandemově umístěné DNA-vazebné HIN domény vykazující rozdílnou vazbu ke strukturám DNA. Bylo prokázáno, že protein IFI16 preferenčně váže struktury G-kvadruplexů oproti jiným strukturám DNA. G-kvadruplexy jsou nekanonické sekundární lokální struktury DNA (nebo RNA), které se snadno formují za fyziologických podmínek v řadě významných regulačních oblastech genomu, nebo jsou součástí genomů řady virů a patogenů. Schopnost rozpoznání, specifické vazby a stabilizace struktur G-kvadruplexů odráží zapojení proteinu IFI16 do buněčných procesů replikace, transkripce a translace a iniciaci vrozených imunitních odpovědí. V první části diplomové práce byly vybranými biofyzikálními metodami charakterizovány sekvence syntetických oligonukleotidů s potenciálem tvorby G-kvadruplexu a izolován protein IFI16 plné délky, který byl následně použit pro in vitro vazebné a kompetitivní vazebné experimenty s charakterizovanými oligonukleotidy. V poslední části práce byly kvasinkové isogenní kmeny lišící se sekvencemi responzivního elementu transformovány plazmidovými vektory pro expresi proteinů p53 a IFI16 s konstitutivními i GAL inducibilními promotory a optimalizován model jednohybridního kvasinkového systému pro studium interakcí proteinu IFI16 in vivo. Z výsledků vyplývá, že většina analyzovaných sekvencí je schopna in vitro tvořit struktury G-kvadruplexu, a to i za přítomnosti pouze jednoho opakování tří a více G-bází. Zatímco přítomnost několika opakování guaninových bází oddělených jednonukleotidovým spacerem vedla k tvorbě intermolekulárních struktur G-kvadruplexů, mutace v původní sekvenci G-kvadruplexu indukovala tvorbu intramolekulárních struktur s rozdílnými konformacemi. In vitro vazebné a kompetitivní vazebné experimenty prokázaly specifickou vazbu proteinu IFI16 ke strukturám G-kvadruplexů bez rozdílů preference vazby proteinu k určité konformaci G-kvadruplexu. Stabilizace struktur G-kvadruplexu in vivo za responzivním elementem transkripčního faktoru (p53) v promotoru reportérového genu indukovala represi transkripce daného genu. Při absenci jakéhokoliv vazebného místa proteinu IFI16 docházelo k protein-proteinové interakci mezi proteiny IFI16 a p53, která vedla ke zvýšení transaktivačního potenciálu proteinu p53, přičemž vazba proteinu p53 a iniciace transkripce reportérového genu byla ovlivněna nejen přítomností motivu G-kvadruplexu a jeho stabilizací, nýbrž i sekvencí DNA sousedící s responzivním elementem p53. | cs |
| dc.description.abstract | This diploma thesis deals with the binding of interferon gamma-inducible protein 16 (IFI16) to DNA with the potential of G-quadruplex formation. The IFI16 protein contains two tandemly located DNA-binding HIN domains showing differential binding to DNA structures. IFI16 protein has been shown to preferentially bind G-quadruplex structures over other nucleic acid secondary structures. G-quadruplexes are secondary local structures of DNA (or RNA) that are easily formed under physiological conditions in a number of important regulatory regions of the genome, or are part of the genomes of a number of viruses and pathogens. The ability to recognize, specifically bind and stabilize G-quadruplex structures explains the involvement of the IFI16 protein in the cellular processes of replication, transcription and translation and the establishment of innate immune responses. In the first part of the thesis, the sequences of synthetic oligonucleotides with the potential for G-quadruplex formation were characterized by selected biophysical methods and the full-length IFI16 protein was isolated, which was subsequently used for in vitro binding and competitive binding experiments with characterized oligonucleotides. In the last part of the work, isogenic yeast strains differing in the sequences of the responsive element were transformed with plasmid vectors for the expression of p53 and IFI16 proteins with constitutive and GAL inducible promoters, and the one-hybrid yeast system model was optimized for the study of IFI16 protein interactions in vivo. The results show that most of the analyzed sequences are able to form G-quadruplex structures in vitro, even in the presence of only one run of three or more G-bases. While the presence of several G-runs separated by a single nucleotide spacer led to the formation of intermolecular G-quadruplex structures, mutation in the original G-quadruplex sequence induced the formation of intramolecular structures with different conformations. In vitro binding and competitive binding experiments demonstrated specific binding of the IFI16 protein to G-quadruplex structures without differences in protein binding preference to a particular G-quadruplex conformation. Stabilization of G-quadruplex structures in vivo behind the transcription factor responsive element (p53) in the gene promoter induced repression of the transcription of the given gene. In the absence of any binding site of the IFI16 protein, a protein-protein interaction between the IFI16 and p53 proteins occurred, which led to an increase in the transactivation potential of the p53 protein, while the binding of the p53 protein and initiation of reporter gene transcription was influenced not only by the presence of the G-quadruplex motif and its stabilization, but and the DNA sequence adjacent to the p53 responsive element. | en |
| dc.description.mark | A | cs |
| dc.identifier.citation | KRATOCHVILOVÁ, L. Analýza vazby proteinu IFI16 na DNA [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2023. | cs |
| dc.identifier.other | 148004 | cs |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11012/209597 | |
| dc.language.iso | cs | cs |
| dc.publisher | Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická | cs |
| dc.rights | Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení | cs |
| dc.subject | IFI16 | cs |
| dc.subject | G-kvadruplex | cs |
| dc.subject | p53 | cs |
| dc.subject | interakce DNA-protein | cs |
| dc.subject | interakce protein-protein | cs |
| dc.subject | cirkulární dichroismus | cs |
| dc.subject | elektroforetický test posunu mobility | cs |
| dc.subject | isogenní kvasinkový systém | cs |
| dc.subject | luciferázové reportérové testy | cs |
| dc.subject | IFI16 | en |
| dc.subject | G-quadruplex | en |
| dc.subject | p53 | en |
| dc.subject | DNA-protein interaction | en |
| dc.subject | protein-protein interaction | en |
| dc.subject | circular dichroism | en |
| dc.subject | electrophoretic mobility shift assay | en |
| dc.subject | isogenic yeast system | en |
| dc.subject | luciferase reporter assays | en |
| dc.title | Analýza vazby proteinu IFI16 na DNA | cs |
| dc.title.alternative | Analysis of IFI16 protein binding to DNA | en |
| dc.type | Text | cs |
| dc.type.driver | masterThesis | en |
| dc.type.evskp | diplomová práce | cs |
| dcterms.dateAccepted | 2023-05-23 | cs |
| dcterms.modified | 2024-05-17-12:50:40 | cs |
| eprints.affiliatedInstitution.faculty | Fakulta chemická | cs |
| sync.item.dbid | 148004 | en |
| sync.item.dbtype | ZP | en |
| sync.item.insts | 2025.03.26 09:59:03 | en |
| sync.item.modts | 2025.01.15 18:20:36 | en |
| thesis.discipline | Chemie bioaktivních látek | cs |
| thesis.grantor | Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. Ústav chemie potravin a biotechnologií | cs |
| thesis.level | Inženýrský | cs |
| thesis.name | Ing. | cs |