Optimalizace izolace DNA z šípků

Abstract

Plod růže šípkové (Rosa canina) nachází využití v potravinářském průmyslu, konkrétně při výrobě čajů. Plody šípku jsou bohaté na různé látky, jako např. fenolické kyseliny, které působí jako kontaminanty při izolaci rostlinné DNA. Tato práce má za cíl upravit CTAB protokol používaný k izolaci rostlinné DNA, aby výsledkem byla dostatečná koncentrace a čistota pro amplifikaci DNA. Zároveň byly sledovány rozdíly mezi izolací DNA z plodu čerstvého a sušeného. Izolační postup s opakovaným přidáním CTAB pufru s 3% polyvinylpyrrolidonem (PVP) neměl žádaný výsledek kvůli vysokému znečištění polyfenolickými látkami nebo proteiny, ale bylo zjištěno, že tato metoda je vhodná pro izolaci DNA z listu růže šípkové. K odstranění kontaminantů byl navržen postup s přidáním vyšší koncentrace PVP v první inkubaci CTAB pufrem. Konkrétně tedy 4% PVP a 5% PVP. Zvyšování koncentrací PVP mělo za důsledek zhoršení amplifikovatelnosti u sušeného plodu. Výsledky PCR a HRM analýzy ukázaly, že izolace z čerstvého plodu opakovaným přidáním CTAB pufru s 4% PVP měla lepší výsledky než použití 5% PVP. Použitím této metody jsme dosáhli identických normalizovaných křivek tání jako u pozitivní kontroly.The fruit of the rosehip (Rosa canina) is used in the food industry, specifically in the tea production. Rosehip fruits are rich in various substances, such as phenolic acids, which are considered contaminants during the isolation process of plant DNA. The purpose of this work is to modify the CTAB protocol used to isolate plant DNA to provide sufficient concentration and purity for amplification of DNA. Simultaneusly, the differences between the isolation of DNA from fresh and dried fruit were investigated. The isolation with repeated use of CTAB buffer with 3% polyvinylpyrrolidone (PVP) did not have the desired result due to high contamination by polyphenolics or proteins, but this method was found suitable for isolation of DNA from rosehip leaf. To remove the contaminants a procedure with addition of higher concentration of PVP in the first incubation with CTAB buffer was proposed. Specifically, 4% PVP and 5% PVP. Increasing PVP concentration resulted in deterioration in amplifiability in dried fruit. The result of PCR and HRM analysis showed that isolation from fresh fruit had better results with use of 4% PVP other than using 5% PVP. Using this method we obtained identical normalized melting curves to the positive control.