Strukturní analýza interakčního rozhraní mezi protilátkou a proteinovým epitopem
Loading...
Date
Authors
ORCID
Advisor
Referee
Mark
B
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Diplomová práce se zabývá studiem myší monoklonální protilátky EEV1-2.1, která byla vytvořena v laboratořích RECAMO imunizací myši proteinem Hsp90 a následnou fúzí splenocytů s myší myelomovou linii. Teoretická část této práce se zaměřuje především na studium protilátek, zejména jejich struktury, genetiky a popis monoklonálních protilátek. V této části práce lze dále najít průřez moderními biotechnologickými trendy, které jsou v současné době používány k produkci protilátek. Dále jsou popsány CHO buňky a tetracyklinové inducibilní systémy. Cílem diplomové práce bylo charakterizovat zmíněnou protilátku. Pomocí bioinformatických metod a predikčních softwarů predikovat a popsat její strukturu, především potom analyzovat hypervariabilní CDR oblasti. Dalším cílem bylo pomocí metody Gateway klonovat lehký a těžký řetězec protilátky. Finálním krokem bylo vytvoření tetracyklinového inducibilního systému pro efektivní produkci samotné protilátky. Experimentální část práce se úvodem zabývá izolací RNA sekvence protilátky pomocí komerčních kitů. Dále je popsána metoda amplifikace dané sekvence pomocí PCR s reverzní transkripcí. Následuje popis metody Gateway klonování, která umožňuje pohodlné vložení vybraného genu do cílového vektoru. Objasněny jsou též základní bioinformatické metody použité ke studiu struktury protilátek a také predikce komplexnější 3D struktury protilátky včetně možných interakcí s proteinem HSP90. V této části lze najít popis metod transfekce ExpiCHO buněk a inducibilní produkce protilátky využívající tetracyklinový inducibilní systém. Diplomová práce vedla k úspěšnému naklonování lehkého a těžkého řetězce protilátky a následnému vložení expresního vektoru do produkčních ExpiCHO buněk. Expresní systém na bázi indukce přídavkem doxycyklinu byl poté úspěšně testován několika metodami a výsledky ukazují, že je inducibilní systém nejen funkční, ale může dokonce vést ke zvýšené produkci monoklonální protilátky oproti konvenčním metodám.
The diploma thesis deals with the study of the mouse monoclonal antibody EEV1-2.1, which was created in the RECAMO laboratories by immunization of mice with the Hsp90 protein and subsequent fusion of splenocytes with a mouse myeloma line. The theoretical part of this work focuses mainly on the study of antibodies, especially their structure, genetics and the description of monoclonal antibodies. In this part of the work, you can also find a cross-section of modern biotechnological trends that are currently used for the production of antibodies. CHO cells and tetracycline inducible systems are also described. The aim of the thesis was to characterize the mentioned antibody. Using bioinformatics methods and prediction software to predict and describe its structure, especially then to analyze hypervariable CDR regions. Another goal was to clone the light and heavy chains of the antibody using the Gateway method. The final step was the creation of a tetracycline inducible system for efficient production of the antibody itself. The experimental part of the work initially deals with the isolation of the RNA sequence of the antibody using commercial kits. Next, the method of amplification of the given sequence using PCR with reverse transcription is described. The following is a description of the Gateway cloning method, which allows convenient insertion of the selected gene into the target vector. The basic bioinformatics methods used to study the structure of antibodies are also explained, as well as the prediction of a more complex 3D structure of the antibody, including possible interactions with the HSP90 protein. This section describes the methods of transfection of ExpiCHO cells and inducible antibody production using the tetracycline inducible system. The thesis led to the successful cloning of the light and heavy chain of the antibody and the subsequent insertion of the expression vector into the production ExpiCHO cells. The expression system based on induction by the addition of doxycycline was then successfully tested by several methods and the results show that the inducible system is not only functional, but can even lead to increased production of monoclonal antibody compared to conventional methods.
The diploma thesis deals with the study of the mouse monoclonal antibody EEV1-2.1, which was created in the RECAMO laboratories by immunization of mice with the Hsp90 protein and subsequent fusion of splenocytes with a mouse myeloma line. The theoretical part of this work focuses mainly on the study of antibodies, especially their structure, genetics and the description of monoclonal antibodies. In this part of the work, you can also find a cross-section of modern biotechnological trends that are currently used for the production of antibodies. CHO cells and tetracycline inducible systems are also described. The aim of the thesis was to characterize the mentioned antibody. Using bioinformatics methods and prediction software to predict and describe its structure, especially then to analyze hypervariable CDR regions. Another goal was to clone the light and heavy chains of the antibody using the Gateway method. The final step was the creation of a tetracycline inducible system for efficient production of the antibody itself. The experimental part of the work initially deals with the isolation of the RNA sequence of the antibody using commercial kits. Next, the method of amplification of the given sequence using PCR with reverse transcription is described. The following is a description of the Gateway cloning method, which allows convenient insertion of the selected gene into the target vector. The basic bioinformatics methods used to study the structure of antibodies are also explained, as well as the prediction of a more complex 3D structure of the antibody, including possible interactions with the HSP90 protein. This section describes the methods of transfection of ExpiCHO cells and inducible antibody production using the tetracycline inducible system. The thesis led to the successful cloning of the light and heavy chain of the antibody and the subsequent insertion of the expression vector into the production ExpiCHO cells. The expression system based on induction by the addition of doxycycline was then successfully tested by several methods and the results show that the inducible system is not only functional, but can even lead to increased production of monoclonal antibody compared to conventional methods.
Description
Citation
MORAVEC, J. Strukturní analýza interakčního rozhraní mezi protilátkou a proteinovým epitopem [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2023.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
cs
Study field
Potravinářská chemie a biotechnologie
Comittee
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
prof. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D. (člen)
doc. RNDr. Renata Mikulíková, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Stanislav Kráčmar, DrSc. (člen)
Date of acceptance
2023-05-29
Defence
1. Student seznámil členy komise s náplní a cílem diplomové práce.
2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci.
3. Student akceptoval všechny připomínky oponenta a na všechny otázky odpověděl v plné šíři.
Diskuse:
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc.
Proč je vhodné měřit interakci protilátky s antigenem Heat-shock proteinu 90? K čemu lze tuto protilátku použít?
prof. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D.
Jak se měří a kvantifikuje množství produkce protilátek? Jaké jsou koncentrace produkce?
prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.
Jaký program jste použil na dokování protilátky s epitopem? Testovali jste účinnost rekombinantních protilátek na lidských buněčných liniích?
Proč jste využívali produkci protilátek v eukaryotickém systému? Jaký je rozdíl mezi použitím prokaryotních a eukaryotních systémů?
Student odpověděl na doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Diplomant prokázal velmi dobré odborné znalosti i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení