Vliv delece PhaZ genu bakterie Rhodospirillum rubrum na vybrané fenotypické a biotechnologické vlastnosti

Abstract

Tato diplomová práce se zabývá delecí genu phaZ2 bakterie Rhodospirillum rubrum a jejím vlivem na výtěžnost PHA a odolnost vůči stresu. Gen phaZ2, který kóduje klíčovou depolymerázu tohoto bakteriálního kmene, byl deletován pomocí dvoukrokové homologní rekombinace (double-crossover) za použití plasmidu pK18mobsacB a konjugace s kmenem Escherichia coli S17-1. Úspěšnost delece byla ověřena pomocí PCR a gelové elektroforézy. Vliv delece na výtěžek PHA byl testován v různých kultivačních médiích (SYN FAY, SYN AY, SYN FY), a také s přídavkem 40 g/L NaCl do každého z testovaných médií. Pro stanovení výtěžku PHA byla využita metoda plynové chromatografie. Nejvyšší výtěžek PHA byl pozorován v médiu SYN AY s přídavkem NaCl, nicméně obecně mutantní kmen Rhodospirillum rubrum phaZ2 nevykazoval zásadně vyšší produkci PHA ve srovnání s kmenem Rhodospirillum rubrum. Pro stanovení stresové odolnosti byly všechny kmeny kultivovány v médiu SYN FAY bez přídavku NaCl. Metodou využitou na tuto analýzu byla průtoková cytometrie. Odolnost vůči stresu byla testována pomocí mrazicích cyklů a teplotního stresu. Kromě výše zmíněných kmenů byl na stresovou odolnost testován také mutantní kmen Rhodospirillum rubrum phaC1C2. Nejnižší odolnost vůči stresu byla pozorována u kmene Rhodospirillum rubrum phaZ2, zatímco nejvyšší odolnost byla zaznamenána u kmene Rhodospirillum rubrum phaC1C2.This thesis aims at the gene deletion of the phaZ2 gene in Rhodospirillum rubrum and its impact on PHA production and stress robustness. The phaZ2 gene, which encodes a key PHA depolymerase in this bacterial strain, was deleted using two-step homologous recombination (double-crossover) with plasmid pK18mobsacB and conjugation with Escherichia coli S17-1. The success of the deletion was confirmed by PCR and gel electrophoresis. The effect of gene deletion on PHA yield was tested in different media (SYN FAY, SYN AY, SYN FY) and also with the supplementation of 40 g/L NaCl. After, the PHA content was determined by gas chromatography. SYN AY medium with the addition of NaCl showed the highest overall PHA yield, but the deletion mutant Rhodospirillum rubrum phaZ2 did not show significantly higher PHA yields compared to Rhodospirillum rubrum. For the sake of stress robustness tests, all strains were cultivated in SYN FAY medium without any addition of NaCl. The method used for this analysis was flow cytometry. The stress robustness was tested by freeze-thaw cycles and high-temperature stress. In addition to the two mentioned strains, another mutant strain, Rhodospirillum rubrum phaC1C2 was tested for stress robustness. Rhodospirillum rubrum phaZ2 was the least stress resistant, while Rhodospirillum rubrum phaC1C2 showed the highest resistance among all strains tested.