Studium metabolismu a produkce polyhydroxyalkanoátů termofilních bakterií rodu Aneurinibacillus

Abstract

Plasty jsou klíčovými materiály v průmyslu, ale jejich nadměrná produkce, spotřeba a neefektivní recyklovatelnost vede k vážným environmentálním problémům. Jednou z potenciálních alternativ k petrochemickým plastům nabízí využití biodegradabilních polyhydroxyalkanoátů (PHA). I přesto, že PHA nabízí mnoho výhod, jejich komercializace čelí několika výzvám, jako jsou vysoké náklady na výrobu a horší fyzikální vlastnosti produkovaných biopolymerů ve srovnání s konvenčními plasty. Řešení těchto výzev by mohla nabízet termofilní bakterie rodu Aneurinibacillus. Tato bakterie disponuje celou řadou unikátních vlastností, mezi které patří například její schopnost využívat širokou škálu substrátů a začleňovat neobvyklé monomery do struktury PHA, čímž vznikají zcela unikátní kopolymery s lepšími fyzikálními vlastnostmi. Lepším pochopením tohoto jedinečného metabolismu za využití molekulárních technik by mohlo přispět k optimalizaci a větší cenové výhodnosti biotechnologické výroby PHA. Tato vyhlídka vedla k vypracování této práce. Konkrétně se práce zaměřovala na kultivaci kmene Aneurinibacillus sp. AFn2 v různých kultivačních podmínkách, a jejich vlivu na expresi genů podílejících se na biosyntéze PHA. V rámci kultivačního experimentu byly vybrány dva rozdílné typy média, které měly imitovat podmínky o odlišné dostupnosti živin. Přesněji se jednalo o komplexní a minerální médium. Další odlišností bylo přidání dvou strukturně rozdílných prekurzorů PHA, a to 1,4-butandiolu a butyrolaktonu. V poslední řadě se kultivační podmínky lišili v délce kultivace (8, 32 a 72 hodin). Po uplynutí kultivační doby bylo v každém čase za využití plynové chromatografie stanoveno množství biomasy, množství PHA a jednotlivé zastoupení monomerů (3HB, 4HB, 3HV). Na závěr byla vykonána RT-qPCR, která sloužila k analýze relativní genové exprese vybraných genů oproti expresi referenčního genu gyrA. Výsledky kultivačních experimentů prokázali, že je kmen Aneurinibacillus sp. AFn2 schopen využívat strukturně různé prekurzory v odlišných kultivačních podmínkách. Také byla potvrzena schopnost bakterie inkorporovat sledované monomery do struktury PHA. V případě měření genové exprese bylo pozorováno, že exprese genů (phaC, phaZ, phaQ, phaJ) byla silně ovlivněna různými kultivačními podmínkami. Naproti tomu geny phaR a fabG byly exprimovány stabilně ve většině pozorovaných časech.Plastics are key materials in industry, but their overproduction, overconsumption and inefficient recycling lead to serious environmental problems. The use of biodegradable polyhydroxyalkanoates (PHA) offers one potential alternative to petrochemical plastics. Although PHAs offer many advantages, their commercialization faces several challenges, such as the high cost of production and the inferior physical properties of the biopolymers produced compared to conventional plastics. Thermophilic bacteria of the genus Aneurinibacillus could offer a solution to these challenges. This bacterium possesses a number of unique properties, including its ability to use a wide range of substrates and incorporate unusual monomers into the PHA structure, resulting in production of completely unique copolymers with improved physical properties. A better understanding of this unique metabolism pathways via molecular techniques could contribute to the optimization and greater cost-effectiveness of biotechnological PHA production. This prospect led to the development of this essay. Specifically, the experimental work focused on the cultivation of strain Aneurinibacillus sp. AFn2 under different cultivation conditions, and their effect on the expression of genes involved in PHA biosynthesis. Two different types of media were selected to mimic conditions of different nutrient availability in the cultivation experiment. More specifically, these were complex and mineral media. Another difference was the addition of two structurally different PHA precursors, namely 1,4-butanediol and -butyrolactone. Lastly, the cultivation conditions differed in the length of cultivation (8, 32 and 72 h). After the cultivation time, the amount of biomass, the amount of PHA and the individual monomer representation (3HB, 4HB, 3HV) were determined at each time using gas chromatography. Finally, RT-qPCR was performed to analyze the relative gene expression of selected genes compared to the expression of the reference gene gyrA. The results of the cultivation experiments demonstrated that the strain Aneurinibacillus sp. AFn2 was able to utilize structurally different precursors under different cultivation conditions. The ability of the bacterium to incorporate the studied monomers into the PHA structure was also confirmed. In the case of gene expression measurements, was observed that the expression of genes (phaC, phaZ, phaQ, phaJ) was strongly affected by different cultivation conditions. In contrast, phaR and fabG genes were stably expressed at most of the observed times.