Vliv nově vyvíjených protinádorových terapeutik na transkripci indukovanou mutantními proteiny p53

Abstract

Tato bakalářská práce se zabývá regulací transkripční aktivity proteinů rodiny p53 (včetně p63 a p73). Protein p53 je významným nádorovým supresorem a atraktivním cílem výzkumu v rámci protinádorových terapií. Protein p53 ovlivňuje řadu buněčných funkcí, jako jsou buněčný metabolismus, ferroptóza, senescence či autofagie. Dalším cílem výzkumu pro nádorovou terapii jsou promotorové G kvadruplexy (G4). Jejich častý výskyt v promotorových oblastech onkogenů a genů podílejících se na opravách DNA vedl k předpokladu, že G-kvadruplexy jsou spojeny s karcinogenezí a ke snaze o přípravu ligandů stabilizujících G4 struktury. V experimentální části byl nejprve zkoumán vliv nově vyvíjených G4 ligandů na různé sekvence s potenciálem tvorby G-kvadruplexu. Pomocí ThT (Thioflavin T) fluorescenčního vazebného testu byla potvrzena přítomnost struktur G4 u sekvencí odvozených s lidských promotorů genů PCNA (PCNA), GDF15 (GDF) a INPP5B (INPP). Tvorba G4 ovšem nebyla jednoznačně prokázána u sekvence Astn2 (Astn2). Pomocí kompetitivního ThT vazebného experimentu byla ověřena interference použitých ligandů, berberinu a kvercetinu s ThT a jejich interakce s vybranými sekvencemi s potenciálem tvorby G4. Lepší vazebné vlastnosti vůči strukturám G-kvadruplexů vykazoval berberin, zatímco kvercetin vykazoval nižší vazebné vlastnosti pravděpodobně z důvodu preferenční vazby na telomerické G4. Dále byla zkoumána bazální aktivita použitých kmenů in vivo v jednohybridním kvasinkovém isogenním systému. In vivo bylo potvrzeno, že sekundární struktury G4 (včetně Astn2 palindromu) zvyšují bazální transkripci kvasinkových kmenů. Za účelem zjištění optimálních koncentrací pro účinnou stabilizaci G4 sekundárních struktur v kvasinkových kmenech a zajištění signifikantního zvýšení aktivity indukované vybranými proteiny rodiny p53, byl testován vliv různých koncentrací vybraných ligandů na bazální transkripci. Nejvýznamnější zvýšení aktivity bylo zaznamenáno při použití 1,95 M a 7,81 M koncentracích berberinu i kvercetinu. Tyto koncentrace byly dále testovány v rámci sledování transkripční aktivity indukované proteiny rodiny p53. Přestože vybrané ligandy při působení na jednotlivé kmeny nevykazovaly jednotný trend, byly prokázány rozdíly u jednotlivých promotorových sekvencí a také rozdíly v rámci koncentrací ligandů. Zatímco 1,95 M koncentrace berberinu významně zvyšovala aktivitu v kmenech obsahující sekvenci odvozenou z promotoru genu Astn2, 7,81 M koncentrace berberinu vykazovala vyšší aktivitu u kmenů odvozených z promotorů genů INPP5B, PCNA a GDF15. U kvercetinu vykazovala významnější zvýšení aktivity u všech kvasinkových kmenů koncentrace 7,81 M. Během experimentů bylo prokázáno zvýšení transkripční aktivity indukované proteiny rodiny p53 vlivem vybraných ligandů. Tato práce tak významně přispívá k rozvoji znalostí nezbytných pro vývoj alternativních postupů léčby onkologických onemocnění, který cílí na komplexní mechanismy regulace transkripční aktivity onkologicky významných proteinů modulované nekanonickými sekundárními strukturami DNA – G-kvadruplexy.This bachelor’s thesis focuses on the regulation of transcriptional activity of the p53 protein family (including p63 and p73). The p53 protein is a key tumor suppressor and an attractive target for research in cancer therapy. P53 influences a number of cellular functions, such as cell metabolism, ferroptosis, senescence, and autophagy. Another promising target in cancer therapy research is promoter G quadruplexes (G4). Their frequent occurrence in the promoter regions of oncogenes and genes involved in DNA repair has led to the assumption that G-quadruplexes are associated with carcinogenesis and has spurred efforts to develop ligands that stabilize G4 structures. In the experimental part of the thesis, the effects of newly developed G4 ligands on various sequences with potential to form G quadruplexes were studied. The presence of G4 structures in sequences derived from human gene promoters PCNA (PCNA), GDF15 (GDF) and INPP5B (INPP) was confirmed using a Thioflavin T (ThT) fluorescence binding assay. However, G4 formation was not clearly demonstrated for the Astn2 (Astn2) sequence. A competitive ThT binding experiment was conducted to verify the interference of the tested ligands, berberine and quercetin, with ThT and their interactions with selected sequences capable of forming G4 structures. Berberine showed better binding properties to G-quadruplex structures, while quercetin exhibited weaker binding, likely due to its preference for telomeric G4s. Next, the basal activity of the used strains was examined in vivo in a one-hybrid yeast isogenic system. In vivo it was confirmed that secondary G4 structures (including the Astn2 palindrome) increase the basal transcription of yeast strains. To determine the optimal concentrations for effective stabilization of G4 secondary structures in yeast strains and to ensure a significant increase in activity induced by selected p53 family proteins, the effect of various concentrations of the ligands on basal transcription was tested. The most significant increase in activity was observed at concentrations of 1.95 µM and 7.81 µM of both berberine and quercetin. These concentrations were further tested to monitor transcriptional activity induced by p53 family proteins. Although the selected ligands did not show a uniform trend across individual strains, differences were observed between the individual promoter sequences as well as between ligand concentrations. While the 1.95 µM concentration of berberine significantly increased activity in strains containing the Astn2 promoter-derived sequence, the 7.81 µM concentration of berberine showed higher activity in strains derived from the INPP5B, PCNA, and GDF15 promoters. For quercetin, the 7.81 µM concentration showed a more significant increase in activity across all yeast strains. During the experiments, an increase in transcriptional activity induced by p53 family proteins as a result of the selected ligands was demonstrated. This work thus makes a substantial contribution to the development of knowledge necessary for the advancement of alternative approaches in cancer treatment targeting complex mechanisms of transcriptional regulation of oncologically relevant proteins modulated by non-canonical secondary DNA structures G-quadruplexes.