Využití retrotransposonu Cassandra pro rozlišení vybraných rostlinných druhů

Abstract

Tato diplomová práce se zabývá molekulární identifikací a rozlišením vybraných druhů rodu Vaccinium (Vaccinium corymbosum – borůvka kanadská, Vaccinium myrtillus – borůvka lesní a Vaccinium vitis-idaea – brusnice brusinka) s využitím polymerázové řetězové reakce (PCR) cílené na retrotransposon Cassandra. V teoretické části jsou detailně popsány botanické a molekulární charakteristiky studovaných druhů, význam a vlastnosti retrotransposonu Cassandra, princip PCR s důrazem na optimalizační postupy, návrh specifických primerů a princip vysokorozlišovací analýzy křivek tání (HRM). V experimentální části práce byly pomocí nástroje Primer-BLAST navrženy čtyři páry specifických primerů, které byly testovány na DNA izolované z vybraných druhů Vaccinium metodou real-time PCR a následnou HRM analýzou. Byla provedena optimaliz.ace PCR reakcí, která zahrnovala úpravu koncentrace primerů a počet amplifikačních cyklů pro dosažení maximální specifity a citlivosti detekce. Výsledky HRM analýzy byly zpracovány porovnáním tvarů křivek tání a kvantifikací jejich podobnosti pomocí výpočtu skóre GCP (genotypového konfidenčního procenta). Nejlepší výsledky pro rozlišení druhů poskytl pár primerů označený jako VcCass2, který vykázal nejvýraznější polymorfismus mezi analyzovanými vzorky.This thesis deals with the molecular identification and differentiation of selected species of the genus Vaccinium (Vaccinium corymbosum, Vaccinium myrtillus and Vaccinium vitis-idaea) using polymerase chain reaction (PCR) targeted to the Cassandra retrotransposon. In the theoretical part, the botanical and molecular characteristics of the studied species, the significance and properties of Cassandra retrotransposon, the principle of PCR with emphasis on optimization procedures, the design of specific primers and the principle of high-resolution melting curve analysis (HRM) are described in detail. In the experimental part of the work, four pairs of specific primers were designed using the Primer-BLAST tool and tested on DNA isolated from selected Vaccinium species by real-time PCR followed by HRM analysis. Optimization of the PCR reactions was performed, which included adjusting the primer concentration and the number of amplification cycles to achieve maximum specificity and sensitivity of detection. The results of the HRM analysis were processed by comparing the shapes of the melting curves and quantifying their similarity by calculating the GCP (genotype confidence percentage) score. The best results for species discrimination were provided by the primer pair designated as VcCass2, which showed the most pronounced polymorphism among the samples analyzed