Optimalizace koncentrace chloridu vápenatého pro odstranění polysacharidové kontaminace při izolaci rostlinné DNA

Abstract

Největší potíž při izolaci DNA je přítomnost kontaminujících látek, které způsobují nežádoucí účinky. V ovoci nejrozšířenějšími kontaminanty jsou polysacharidy. Spolu s dalšími látkami (například proteiny nebo fenolické látky) můžou zkreslovat výsledky při spektrofotometrickém stanovení čistoty nebo působit jako inhibitory při PCR analýze. Cílem této práce bylo zkoumaní vlivu různých koncentrací chloridu vápenatého na proces izolace DNA. V experimentální části byla izolovaná DNA z jablka pomocí různě koncentrovaných roztoků chloridu vápenatého. Izolace byla provedena čtyřikrát a pokaždé byl vzorek upraven různými způsoby. Bylo zjištěno, že použitá izolační metoda funguje jenom na vzorku, který byl předem lyofilizován. Izolace DNA z čerstvého plodu poskytovala velmi nízké výtěžky. Pravděpodobně to bylo způsobeno velkým obsahem vody ve vzorku a podíl pevné složky byl menší. Následně byly provedeny PCR analýza a elektroforéza pro zjištění amplifikovatelnosti izolované DNA. Pro tyto analýzy byly použity dvě sady primerů s různou specifitou. Při použití 100 mM roztoku CaCl2 byla potvrzena amplifikovatelnost pouze při použití primerů specifických pro DNA jabloně. U ostatních vzorků byly prokázány amplifikovatelnost při použití obou typů primerů. Pravděpodobně, vzorky izolovány pomocí 100 mM roztoku CaCl2 měly větší množství inhibitorů, které neovlivňují všechny PCR reakce stejně, což také může ukazovat na malou účinnost tohoto množství CaCl2.The greatest difficulty in isolating DNA is the presence of contaminants that cause side effects. Polysaccharides are the most common contaminants in fruits. They can distort the results in spectrophotometric determination of purity or act as inhibitors in PCR analysis together with other substances (for example, proteins or phenolic substances). The aim of this work was to investigate the influence of different concentrations of calcium chloride on the process of DNA isolation. In the experimental part, DNA from the apple was isolated using different concentrations of calcium chloride. The isolation was carried out four times, and each time the sample was adjusted in different ways. It was found that the isolation method used works only with a sample that has been lyophilized. Isolation of DNA from fresh fruit provided very low yields. Probably, this was due to the large water content in the sample, and the proportion of the solid component was smaller. Subsequently, PCR analysis and electrophoresis were performed to determine the amplifiability of the isolated DNA. Two sets of primers with different specificity were used for this analysis. Amplifiability was confirmed only when using primers specific to apple DNA when using 100 mM solution of CaCl2. Other samples have been amplifiable using both types of primers. Probably, samples isolated using a 100 mM solution of CaCl2 had a larger amount of inhibitors that do not affect all PCR reactions equally, which may also indicate a small effectiveness of this amount of CaCl2.