Optimalizace koncentrace chloridu vápenatého pro odstranění polysacharidové kontaminace při izolaci rostlinné DNA
Loading...
Date
Authors
Frnčová, Ekaterina
ORCID
Advisor
Referee
Mark
B
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Největší potíž při izolaci DNA je přítomnost kontaminujících látek, které způsobují nežádoucí účinky. V ovoci nejrozšířenějšími kontaminanty jsou polysacharidy. Spolu s dalšími látkami (například proteiny nebo fenolické látky) můžou zkreslovat výsledky při spektrofotometrickém stanovení čistoty nebo působit jako inhibitory při PCR analýze. Cílem této práce bylo zkoumaní vlivu různých koncentrací chloridu vápenatého na proces izolace DNA. V experimentální části byla izolovaná DNA z jablka pomocí různě koncentrovaných roztoků chloridu vápenatého. Izolace byla provedena čtyřikrát a pokaždé byl vzorek upraven různými způsoby. Bylo zjištěno, že použitá izolační metoda funguje jenom na vzorku, který byl předem lyofilizován. Izolace DNA z čerstvého plodu poskytovala velmi nízké výtěžky. Pravděpodobně to bylo způsobeno velkým obsahem vody ve vzorku a podíl pevné složky byl menší. Následně byly provedeny PCR analýza a elektroforéza pro zjištění amplifikovatelnosti izolované DNA. Pro tyto analýzy byly použity dvě sady primerů s různou specifitou. Při použití 100 mM roztoku CaCl2 byla potvrzena amplifikovatelnost pouze při použití primerů specifických pro DNA jabloně. U ostatních vzorků byly prokázány amplifikovatelnost při použití obou typů primerů. Pravděpodobně, vzorky izolovány pomocí 100 mM roztoku CaCl2 měly větší množství inhibitorů, které neovlivňují všechny PCR reakce stejně, což také může ukazovat na malou účinnost tohoto množství CaCl2.
The greatest difficulty in isolating DNA is the presence of contaminants that cause side effects. Polysaccharides are the most common contaminants in fruits. They can distort the results in spectrophotometric determination of purity or act as inhibitors in PCR analysis together with other substances (for example, proteins or phenolic substances). The aim of this work was to investigate the influence of different concentrations of calcium chloride on the process of DNA isolation. In the experimental part, DNA from the apple was isolated using different concentrations of calcium chloride. The isolation was carried out four times, and each time the sample was adjusted in different ways. It was found that the isolation method used works only with a sample that has been lyophilized. Isolation of DNA from fresh fruit provided very low yields. Probably, this was due to the large water content in the sample, and the proportion of the solid component was smaller. Subsequently, PCR analysis and electrophoresis were performed to determine the amplifiability of the isolated DNA. Two sets of primers with different specificity were used for this analysis. Amplifiability was confirmed only when using primers specific to apple DNA when using 100 mM solution of CaCl2. Other samples have been amplifiable using both types of primers. Probably, samples isolated using a 100 mM solution of CaCl2 had a larger amount of inhibitors that do not affect all PCR reactions equally, which may also indicate a small effectiveness of this amount of CaCl2.
The greatest difficulty in isolating DNA is the presence of contaminants that cause side effects. Polysaccharides are the most common contaminants in fruits. They can distort the results in spectrophotometric determination of purity or act as inhibitors in PCR analysis together with other substances (for example, proteins or phenolic substances). The aim of this work was to investigate the influence of different concentrations of calcium chloride on the process of DNA isolation. In the experimental part, DNA from the apple was isolated using different concentrations of calcium chloride. The isolation was carried out four times, and each time the sample was adjusted in different ways. It was found that the isolation method used works only with a sample that has been lyophilized. Isolation of DNA from fresh fruit provided very low yields. Probably, this was due to the large water content in the sample, and the proportion of the solid component was smaller. Subsequently, PCR analysis and electrophoresis were performed to determine the amplifiability of the isolated DNA. Two sets of primers with different specificity were used for this analysis. Amplifiability was confirmed only when using primers specific to apple DNA when using 100 mM solution of CaCl2. Other samples have been amplifiable using both types of primers. Probably, samples isolated using a 100 mM solution of CaCl2 had a larger amount of inhibitors that do not affect all PCR reactions equally, which may also indicate a small effectiveness of this amount of CaCl2.
Description
Keywords
Ovoce, jablko, rostlinný vzorek, izolace DNA, polysacharidy, polysacharidová kontaminace, chlorid vápenatý, polymerázová řetězová reakce (PCR), elektroforéza, Fruit, apple, plant sample, DNA isolation, polysaccharides, polysaccharide contamination, calcium chloride, polymerase chain reaction (PCR), electrophoresis
Citation
FRNČOVÁ, E. Optimalizace koncentrace chloridu vápenatého pro odstranění polysacharidové kontaminace při izolaci rostlinné DNA [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2024.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
cs
Study field
bez specializace
Comittee
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. Ing. Filip Mravec, Ph.D. (místopředseda)
prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
doc. RNDr. Renata Mikulíková, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
Date of acceptance
2024-06-10
Defence
1. Studentka seznámila členy komise s náplní a cílem bakalářské práce.
2. Byly přečteny posudky na bakalářskou práci.
3. Studentka akceptovala všechny připomínky oponentky a na otázky odpověděla v plné šíři.
Diskuse:
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc.
Prokázali jste ve všech výrobcích, kde deklarovali jablka, že tam opravdu byly? Co je tedy závěrem Vaší práce? Aplikovala jste Vaše poznatky i na reálně vzorky?
prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.
Jakou metodu izolace DNA jste použili? Jakou část jablka jste použili pro izolaci DNA? Zkoušeli jste různé části? Byla slupka součástí vzorku, který sloužil k izolaci?
doc. RNDr. Renata Mikulíková, Ph.D.
V práci jste používali chlorid vápenatý pro odstranění polysacharidové kontaminace, je možné použít i něco jiného?
Studentka odpověděla na doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. Studentka prokázala velmi dobré odborné znalosti i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení