but.defence	Předsedkyně komise představila doktorandku. Mgr. Konečná absolvovala 9 ti měsíční stáž na univerzitě v Huelvě, (Španělsko, program Erasmus+). V rámci pedagogické činnosti na FCH vedla praktika z biotechnologie a molekulární biotechnologie. Má 1 publikaci v impaktovaném časopise, dále několik konferenčních příspěvků. Ve své powerpointové prezentaci představila podstatné výsledky své dizertační práce.	cs
but.jazyk	čeština (Czech)
but.program	Chemie a technologie potravin	cs
but.result	práce byla úspěšně obhájena	cs
dc.contributor.advisor	Obruča, Stanislav	cs
dc.contributor.author	Konečná, Jana	cs
dc.contributor.referee	Doškař, Jiří	cs
dc.contributor.referee	Kráčmar, Stanislav	cs
dc.date.created	2019	cs
dc.description.abstract	Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Výsledky analýzy HRM – PCR ukazují rozdíly mezi sledovanými metodami extrakce použitými pro izolaci DNA.	cs
dc.description.abstract	Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol-chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time-consuming and requires the use of toxic phenol. Alternative method of DNA isolation is use of commercially available kits which, however, are expensive and their efficiency is low. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solid-phase DNA extraction. Magnetic microparticles P(HEMA – co – GMA) containing –NH2 group and nanoparticles PLL, whitch contains polylysine. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed on the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. After optimalization, the developed method was used for DNA isolation from real food supplements. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this thesis, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F – V1R, CHAU - V3F – CHAU - V3R, CHAU - V6F – CHAU - V6R, poxcDNAFw – poxPromRVC, poxcDNAFw – poxPromRVT) were tested for amplification of the 16S rRNA gene. Use of GroF/R and LAC2/4 primers pairs successfully identify strains belong to the Lactobacillus group. The variance between used extraction methods for evidence of HRM curves was found.	en
dc.description.mark	P	cs
dc.identifier.citation	KONEČNÁ, J. Využití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2019.	cs
dc.identifier.other	120310	cs
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/11012/178205
dc.language.iso	cs	cs
dc.publisher	Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická	cs
dc.rights	Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení	cs
dc.subject	Lactobacillus	cs
dc.subject	Magnetické částice	cs
dc.subject	Extrakce na pevné fázi	cs
dc.subject	Izolace deoxyribonukleové kyseliny	cs
dc.subject	Polymerázová řetězová reakce	cs
dc.subject	Vysokorozlišovací analýza křivek tání	cs
dc.subject	Lactobacillus	en
dc.subject	Magnetic particles	en
dc.subject	Solid-phase extraction	en
dc.subject	Deoxyribonucleic acid isolation	en
dc.subject	Polymerase chain reaction	en
dc.subject	High-Resolution Melting Analysis	en
dc.title	Využití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií	cs
dc.title.alternative	Use of Molecular Biology Techniques for Identification and Analysis of Probiotic Bacteria	en
dc.type	Text	cs
dc.type.driver	doctoralThesis	en
dc.type.evskp	dizertační práce	cs
dcterms.dateAccepted	2019-05-22	cs
dcterms.modified	2019-05-23-13:06:57	cs
eprints.affiliatedInstitution.faculty	Fakulta chemická	cs
sync.item.dbid	120310	en
sync.item.dbtype	ZP	en
sync.item.insts	2025.03.27 11:51:56	en
sync.item.modts	2025.01.17 11:11:11	en
thesis.discipline	Potravinářská chemie	cs
thesis.grantor	Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. Ústav chemie potravin a biotechnologií	cs
thesis.level	Doktorský	cs
thesis.name	Ph.D.	cs

Využití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií

Files

Original bundle

Collections