KONEČNÁ, J. Využití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2019.
Studentka Mgr. Jana Konečná se ve své disertační práci věnovala studiu využití molekulárních technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií. Ze své pozice školitele, jehož hlavní rolí bylo především pomoci studentce připravit revidovanou verzi disertační práce, musím ocenit její přístup k práci, zájem o studovanou problematiku a také přehled v dané oblasti. Studentka k revizi práce přistoupila aktivně, měla zájem o konzultace, poctivě dodržovala interní termíny a celkově v rámci revize disertační práce odvedla veliké množství práce. Proto její přístup hodnotím velice pozitivně. Z mého pohledu všechny provedené změny zvýšili kvalitu předložené práce, byla odstraněna drtivá většina formálních nedostatků, práci byla dodána logika a struktura odpovídající standardní závěrečné práci, byla také posílena diskuze výsledků, takže disertační práce splňuje všechna kritéria kladené na odbornou práci dané úrovně. Studentka splnila všechny formální i odborné nároky kladené na studenty doktorského studia, přepracovala svou disertační práci tak, aby splnila všechny formální i odborné parametry a prokázala zájem o obor. Proto doporučuji její práci k obhajobě.
Disertační práce Jany Konečné je svou problematikou zaměřena na molekulární diagnostiku vybraných druhů bakterií mléčného kvašení, které jsou využívány v potravinářském průmyslu a jsou součástí probiotických preparátů. Vzhledem ke stále se zvyšujícímu významu probiotik pro udržení zdraví člověka je žádoucí znát vlastnosti jednotlivých bakteriálních druhů a současně mít vhodné metody pro jejich identifikaci a kvantifikaci, což umožňuje posoudit deklarované složení a tím i kvalitu probiotických potravin. Zvolené téma disertace proto považuji za aktuální. Konkrétně bylo úkolem Mgr. Konečné optimalizovat podmínky adsorpce a eluce DNA na magnetické nosiče využívané pro izolaci DNA a její následnou analýzou prokázat přítomnost jednotlivých druhů bakterií v reálných vzorcích, a dále v případě probiotických bakterií prokázat též přítomnost specifických genů týkajících se probiotických vlastností. Dalším úkolem bylo využít k identifikaci bakterií mléčného kvašení též metodu HRM-PCR a posoudit její vhodnost pro tento účel. Práce je sepsána v českém jazyce na 104 stranách. Je rozčleněna na teoretickou část, kterou představuje rešerše z literárních zdrojů shrnující základní informace o probiotických bakteriích, struktuře jejich genomu a genům týkajícím se probiotických vlastností. Následuje charakterizace antimikrobiálních látek, které mohou být produkovány některými druhy těchto bakterií a přispívat tak k jejich probiotickým vlastnostem. Závěr je pak věnován charakterizaci magnetických částic a popisu metod PCR a HRM používaným k identifikaci a analýze probiotických mikroorganismů. Po teoretické části následuje část experimentální, rozdělená na kapitoly Materiál, Metody, Výsledky a diskuze a Závěr. Následující část Přílohy obsahuje deset obrázků. Úvodní část svědčí o tom, že se autorka v odpovídající šíři seznámila s řešenou problematikou a vybranými metodami, které jsou pro detekci a charakterizaci probiotických bakterií využívány. K sepsání čerpala z rozsáhlého souboru odborných článků, jak vyplývá z uvedeného přehledu literatury. V úvodu experimentální části je představen soubor používaných kmenů r. Lactobacillus a Streptococcus pocházejících ze sbírek mikroorganismů (Univerzita v Ljubljaně a ČSM na MU) a dále pak již izolovaná DNA z kmenů Bifidobacterium. Podrobně jsou popsány zdroje a vlastnosti použitých magnetických nosičů, dála pak testované probiotické výrobky a chemikálie. V kapitole Metody je popsána kultivace bakterií, postupy použité pro izolaci DNA z bakteriálních kultur a probiotických preparátů (fenolová extrakce, komerční soupravy, magnetické částice) a jsou uvedeny podmínky, které byly pro optimalizaci těchto postupů optimalizovány. V následující části metod je pak představena instrumentace pro PCR a HRM-PCR, podmínky, za nichž byly analýzy prováděny včetně sekvence primerů pro amplifikaci.a detekce produktů. Následující kapitoly představují dosažené výsledky získané při řešení dílčích úkolů. Jako první je hodnoceno testování podmínek adsorpce modelové DNA z kuřecích erytrocytů na magnetické částice a její následná eluce při změnách složení a pH pufrů a volbě magnetických částic. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách, kde jsou uvedena množství navázané a eluované DNA a rovněž její čistota jako důležitý parametr pro následné analýzy. PCR a HRM-PCR – výsledky těchto analýz jsou pak prezentovány formou elektroforetogramů (PCR) a křivek tání (HRM-PCR). Dosažené výsledky provedeného testování a analýz vzorků jsou dokumentovány hodnotami v tabulkách, elektroforetogramy a křivkami získanými analýzou PCR-HRM a jsou konfrontovány s výsledky podobných analýz, provedených jinými autory. Celkově vyhodnocení získaných dat považuji za objektivní, zejména cenné je uvedení limitů spolehlivosti použitých metod, které může ovlivnit výsledky analýz. Splnění cílů práce (které bohužel nejsou v práci explicitně formulovány) lze posoudit z kapitoly Závěr. K těm nejvýznamnějším patřilo testování a posouzení vhodných podmínek pro adsorpci DNA na magnetické částice a pro její následnou eluci. Optimalizace postupu izolace DNA z kmene L. gasseri byla pak základem pro provedení rodové a druhové identifikace bakterií v probiotických preparátech, což byl patrně hlavní cíl práce. Z metodického hlediska je cenným zjištěním, že metoda PCR-HRM vyžaduje pro poskytnutí spolehlivých výsledků použití vhodné metody izolace DNA a pečlivý výběr primerů pro výchozí PCR. Z předložené práce je zřejmé, že uchazečka zvládla potřebné experimentální metody a dosáhla nových výsledků využitelných při analýze mikrobiálního složení probiotických potravin. Dosažené výsledky publikovala v impaktovaném časopise a prezentovala na 8 tuzemských či zahraničních konferencích. Práci proto doporučuji k obhajobě.
eVSKP id 120310