Izolace DNA a identifikace nepatogenních druhů klostridií izolovaných ze sýrů

Abstract

V potravinářství jsou požadovány rychlé a přesné metody identifikace bakterií při mikrobiologickém testování produktů. Molekulárně diagnostické metody jsou založené na izolaci DNA z bakteriálních buněk, která je amplifikována v polymerázové řetězové reakci (PCR). Výsledkem je fragment DNA o specifické velikosti, charakteristický pro rod nebo druh bakterie. Cílem práce bylo izolovat bakteriální DNA v kvalitě vhodné pro použití v PCR. DNA byla izolována z 8 kmenů bakterií rodu Clostridium. Byl optimalizován postup lyze buněk s cílem nalézt optimální koncentraci EDTA a proteinázy K v lyzačním pufru. DNA byla izolována fenolovou extrakcí a pomocí magnetických částic. Pro izolaci DNA pomocí fenolové extrakce byly zjištěny jako nejvhodnější koncentrace pro lyzi buněk 10 mM EDTA a 10 l proteinázy K (100 g/ml). Pro izolaci DNA pomocí magnetických částic byly zjištěny jako nejvhodnější koncentrace pro lyzi buněk 10 mM EDTA a 15 l proteinázy K (100 g/ml). Izolovaná DNA byla detegována gelovou elektroforézou, kvantifikována spektrofotometricky a testována v PCR. Jednotlivé druhy byly rozlišeny pomocí denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE).In the food industry are requested speedy and accurate methods for identification of bacteria in microbiological testing of products. Molecular diagnostic methods are based on isolation of DNA from bacterial cells which is amplified in polymerase chain reaction (PCR). The result is fragment DNA about specific size, characteristic for genus or species of bacteria. The aim of the work was isolation of PCR-ready DNA. DNA has been isolated from 8 strains of genus Clostridium. Procedure of cell lysis was optimized in order to find the optimal concentration of EDTA and proteinase K in lysing buffer. DNA was isolated by phenol extraction and using magnetic microspheres. Concentrations 10 mM of EDTA and 10 l of proteinase K (100 g/ml) were the best for cell lysis for isolation of DNA by phenol extraction. Concentrations 10 mM of EDTA and 15 l of proteinase K (100 g/ml) were the best for cell lysis for isolation of DNA by magnetic microspheres. Isolated DNA was checked by gel electrophoresis, quantificated by spectrophotometry and tested in PCR. Individuals species were distinguished in denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE).