Sledování vlivu vybraných rostlinných kontaminantů na průběh a výsledek real-time PCR-HRM analýzy

Abstract

Izolace rostlinné DNA je často komplikována přítomnosti kontaminujících látek, jako jsou polysacharidy nebo fenolické látky. Tyto kontaminanty mohou působit jako inhibitory PCR. V této práci bylo zkoumáno, zda a jakým způsobem vybrané kontaminanty – katechin (zástupce fenolických látek) a pektin (zástupce polysacharidů) ovlivňují účinnost real-time PCR-HRM analýzy. V experimentální části byly tyto inhibitory záměrně přidávány k izolované DNA z listu jahody v různých koncentracích. Pro analýzu bylo vybráno pět párů primerů, za účelem zjistit souvislost mezi jejich vlastnostmi a mírou inhibice. Bylo prokázáno, že se zvyšující se koncentrací katechinu i pektinu došlo k výrazné inhibici PCR, kde v některých případech k tvorbě amplikonů vůbec nedošlo. Míra inhibice se projevila i v závislosti na použitých primerech. Nejlepší výsledky prokazovaly primery CAD1A, u nichž byla inhibice nejnižší, zatímco nejhorší výsledky byly pozorovány pro primery 26S, kde byla inhibice nejvýraznější. Při porovnání samotných vlastností primerů nebyla prokázána jednoznačná souvislost mezi délkou nebo teplotou tání primerů a mírou inhibice. Nejdůležitější se zdál být typ amplifikované sekvence. Primery CAD1A specifické pro enzym jahodníku byly vůči inhibitorům odolnější než univerzální primery 26S. Bylo tedy vypozorováno, že vhodný výběr primerů má významný vliv na analýzu DNA.Isolation of plant DNA is often complicated by the presence of contaminants such as polysaccharides or phenolics. In this work, it was investigated whether and how selected contaminants, catechin (a representative of phenolic substances) and pectin (a representative of polysaccharides), affect the efficiency of real-time PCR-HRM analysis. In the experimental part, these inhibitors were deliberately added to the isolated DNA from strawberry leaf at different concentrations. Five pairs of primers were selected for analysis to investigate the relationship between their properties and the degree of inhibition. It was shown that with increasing concentrations of both catechin and pectin there was a significant inhibition of PCR, where in some cases no amplicon formation occurred. The degree of inhibition also varied depending on the primers used. The best results were shown by CAD1A primers, where inhibition was lowest, while the worst results were observed for 26S primers, where inhibition was most pronounced. When comparing the properties of the primers themselves, there was no clear correlation between the length or melting temperature of the primers and the degree of inhibition. The type of amplified sequence seemed to be the most important. CAD1A primers specific for strawberry enzymes were more resistant to inhibitors than the universal 26S primers. Thus, it was observed that the appropriate choice of primers has a significant impact on DNA analysis.