Metody studia fosfoproteinů rostlin

Abstract

Reverzibilně fosforylované proteiny se uplatňují u řady základních buněčných procesů. Příkladem je přenos cytokininového signálu u rostlin, který je zprostředkovaný tzv. dvou-komponentním systémem zahrnujícím fosforylaci histidinu a aspartátu. Vzhledem k velmi nízké stabilitě fosforylace těchto aminokyselin je obtížné najít vhodnou metodu pro její studium. Předložená bakalářská práce se ve své teoretické části zabývá jak současnými experimentálními přístupy pro analýzu fosforylace proteinů dvou-komponentních systémů, tak hledáním nových způsobů pro tuto analýzu. Jsou zde popsány metody založené na značení proteinů pomocí [?-32P]ATP a na detekci uvolněného fosfátu pomocí kolorimetrických metod nebo pomocí ICP-MS. Další možností je citlivá identifikace fosforylovaných a ne-fosforylovaných forem proteinu fúzovaného s GFP pomocí techniky CE-LIF. Praktická část práce se věnuje optimalizaci vybraných kolorimetrických metod a přípravě proteinu AHP5 fúzovaného s GFP pro analýzu CE-LIF.Reversibly phosphorylated proteins play a role in many fundamental cellular processes. An example is the cytokinin signal transduction pathway in plants that is mediated by the so-called two-component system involving histidine and aspartate phosphorylation. Due to the very low stability of phosphorylation of these amino acids, is difficult to find a suitable method for phosphorylation studies. The theoretical part of this bachelor thesis describes not only the current experimental approaches for analysis of protein phosphorylation in two-component systems but also is trying to propose new approaches for this analysis. There are described methods based on labeling of proteins using [?-32P] ATP and on the detection of released phosphate employing the colorimetric method or ICP-MS. Another possibility is sensitive identification of phoshorylated and non-phosphorylated forms of protein fused with GFP using CE-LIF technique. The practical part of the thesis deals with optimization of the selected colorimetric methods and also is focused on the preparation of the AHP5 protein fused with GFP for CE-LIF analysis.