Využití mikroskopie atomárních sil při komplexní analýze morfologie a mechanických vlastností mikroorganismů

Abstract

Cílem diplomové práce bylo provedení morfologické analýzy a charakterizace mechanických vlastností mikrobiálních buněk pomocí mikroskopie atomárních sil (AFM). Jako modelové mikroorganismy byly zvoleny Cupriavidus necator H16 produkující polyhydroxyalkanoáty (PHA) a Cupriavidus necator PHB-4 neprodukující PHA. Oba tyto mikroorganismy byly taktéž stresovány vysokou teplotou a silně kyselým prostředím pro vyšší rozmanitost vzorků. Fixace buněk byla prováděna pomocí Poly-L-lysinu naneseného na plazmatem upravené Petriho misky. Experimentální část práce se zaměřuje na optimalizaci postupu měření a vyhodnocení mechanických vlastností mikrobiálních buněk pomocí AFM. Byly testovány hroty MLCT – A, MLCT-SPH-1UM-DC – A a MLCT-BIO – A. Dále byl testován zobrazovací režim QI™ a režim silové spektroskopie. V rámci mechanických vlastností byl vyhodnocován Youngův modul metodou proložení silové křivky pomocí Hertzova matematického modelu v programu JPK Data Processing a metodou využívající směrnice strmě klesající části silové křivky. Výstupem práce byly topografické snímky pro nativní i stresované buňky Cupriavidus necator H16 a Cupriavidus necator PHB-4, u kterých byl pozorován rozdíl v jejich morfologii. Dalším výstupem práce byla optimalizovaná metoda měření mikrobiálních buněk pomocí AFM využívající hrot MLCT-BIO – A a režimu silové spektroskopie. Jako spolehlivější metoda vyhodnocení byla označena metoda využívající směrnic. Se získaných výsledků nebylo mezi jednotlivými typy měřených buněk možné pozorovat jednoznačný rozdíl v mechanických vlastnostech z důvodu vysoké variability získaných Youngových modulů i směrnic. Avšak byla objevena mocninná závislost mezi vypočtenými Youngovými moduly a získanými směrnicemi. V rámci měření pomocí režimu silové spektroskopie byla objevena adhezní část silové křivky, ze které byla vyhodnocována adheze pomocí metody využívající plochy píku, která byla v rámci práce navržena.The aim of this thesis was to perform morphological analysis and characterize the mechanical properties of microbial cells using atomic force microscopy (AFM). As model microorganisms, Cupriavidus necator H16 (a producer of polyhydroxyalkanoates, PHA) and Cupriavidus necator PHB-4 (a non-producer of PHA) were selected. Both strains were also subjected to stress conditions, including high temperature and strongly acidic environments, to increase sample diversity. Cell fixation was carried out using poly-L-lysine applied to plasma-treated Petri dishes. The experimental part of the work focused on optimizing the measurement procedure and evaluating the mechanical properties of microbial cells using AFM. The AFM probes tested included MLCT–A, MLCT-SPH-1UM-DC–A, and MLCT-BIO–A. In addition, the QI™ imaging mode and force spectroscopy mode were evaluated. Mechanical properties were assessed by determining the Young’s modulus through two approaches: fitting the force curve using the Hertz mathematical model in JPK Data Processing software and analyzing the slope of the steep descending part of the force curve. The outputs of the work included topographical images of both native and stressed C. necator H16 and PHB-4 cells, revealing morphological differences between them. Another outcome was the optimized AFM measurement method for microbial cells using the MLCT-BIO–A probe and the force spectroscopy mode. The slope-based method was identified as the more reliable approach for mechanical property evaluation. Despite the extensive data collected, no clear differences in mechanical properties were observed between the different cell types due to high variability in the measured Young’s moduli and slopes. However, a power-law relationship between the calculated Young’s moduli and the corresponding slopes was identified. Furthermore, the force spectroscopy mode revealed an adhesive portion of the force curve. A new method based on the area under the adhesion peak was proposed and used for adhesion analysis.