Analýza DNA Lactobacillus s využitím PCR v reálném čase a HRM analýzy

Abstract

K rychlé a přesné identifikaci bakterií rodu Lactobacillus, které jsou významnou součástí běžné gastrointestinální mikroflóry a fermentovaných mléčných výrobků, jsou v současné době využívány především amplifikační metody. Cílem práce bylo analyzovat možnost rozlišení vybraných bakteriálních kmenů rodu Lactobacillus pomocí metody polymerázové řetězové reakce v reálném čase v kombinaci s vysokorozlišovací analýzou křivek tání (qPCR-HRM). Celkem bylo testováno 5 primerů navržených pro qPCR HRM analýzu bakterií mléčného kvašení. Specifita použitých primerů byla současně ověřena i pomocí bioinformatické analýzy. Na základě analýzy DNA byly pro rozlišení testovaných kmenů rodu Lactobacillus jako nejvhodnější vybrány primery P1V1/P2V2, V3F/V3R a V6F/V6R. Vhodnost primerů V3F/V3R a V6F/V6R byla ověřena i na komplexním vzorku doplňku stravy, ze kterého byla DNA izolována pomocí magnetických částic. U DNA z těchto vyizolovaných buněk byla provedena vysokorozlišovací analýza křivek tání, pomocí které byla prokázána přítomnost bakterií rodu Lactobacillus. Získané výsledky se shodovaly s údaji uvedenými výrobcem.The rapid and accurate identification of the bacterium of the genus Lactobacillus, which are an important part of the normal gastrointestinal microflora and fermented dairy products are currently mainly used amplification methods. The aim of the study was to analyze the possibility of resolution of selected bacterial strains of the genus Lactobacillus, using the metod of polymerase chain reaction in the real time combined with high resolution melting curve analysis (qPCR HRM). It was tested five primers designed for qPCR-HRM analysis of lactic acid bacteria. The specificity of the primers was also verified simultaneously using bioinformatic analysis. On the basis of analysis of the DNA were selected as the most appropriate primers P1V1/P2V1, V3F/V3R and V6F/V6R. The suitability of the primers V3F/V3R and V6F/V6R was verified on a complex sample of food supplement from which the DNA was isolated using magnetic particles. The presence of bacteria of the genus Lactobacillus was performed using high resoluting melting analysis curves. The obtained results were in agreement with the information given by the manufacturer.