Využití molekulárních technik při studiu termofilních mikroorganismů
Loading...
Date
Authors
Dvořáková, Dominika
ORCID
Advisor
Referee
Mark
A
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Polyhydroxyalkanoáty jsou mikrobiální zásobní polymery představující ekologickou alternativu k petrochemickým plastům. Vysoká produkční cena však brání jejich širšímu uplatnění na trhu. Využití odpadních látek jako substrátu a/nebo produkce pomocí extremofilních organismů mohou ovšem výrobní náklady snížit. Rod termofilních bakterií Aneurinibacillus je jedním z potenciálních předmětů zájmu v této oblasti zejména díky schopnosti produkce široké palety netradičních kopolymerů. Zajímavá je i nezávislost syntézy PHA na limitaci živinami, jejíž studium se stalo jedním z hlavních cílů této práce především se zaměřením na expresi genů zapojených do syntézy PHA. Konkrétně byl studován kmen Aneurinibacillus sp. AFn2 na různých typech produkčních médií. Přítomnost vybraných genů byla ověřena pomocí klasické PCR. Následně byly provedeny kultivační experimenty na minerálním a komplexním médiu simulující prostředí s různou dostupností živin. V průběhu měření růstové křivky na obou médiích byla ze vzorků odebíraných v různých časech gravimetricky stanovována koncentrace biomasy a současně s pomocí plynové chromatografie i obsah PHA. Na závěr byla analyzována exprese studovaných genů pomocí RT-qPCR, která odhalila výrazné odlišnosti transkripce jednotlivých genů v závislosti na typu média a na čase kultivace. Výsledky potvrdily, že schopnost produkce PHA u Aneurinibacillus sp. AFn2 není závislá na limitaci živinami, ovšem míra zaplnění buněk produkovaným polymerem s typem média souvisí. Příčinou je pravděpodobně rozdílný průběh exprese genů zapojených do syntézy PHA. Na komplexním médiu bylo pozorováno vyšší procentuální zaplnění buněk polymerem P(3HB) a současně rostoucí trend exprese všech genů. Naopak na minerálním médiu transkripce jednotlivých genů po počáteční silné exprimaci pouze klesala a také zaplnění buněk bylo nižší. Získané poznatky přispívají k pochopení nejen exprese vybraných genů ale také celkové syntézy PHA. Současně otevírají cestu k optimalizaci produkce s cílem snížit výrobní cenu a rozšířit tak jejich uplatnění.
Polyhydroxyalkanoates are microbial storage polymers that represent a green alternative to petrochemical plastics. However, their high production cost limits wider industrial utilization. Use of waste materials as a substrate and/or utilization of extremophilic organisms is an option to reduce production costs. The strain of thermophilic bacteria Aneurinibacillus appears to be a promising producer because of its ability to synthesize wide range of non traditional copolymers. In addition, PHA synthesis is independent of nutrient limitation, which was the subject of this study. Experiments were focused on the expression of genes involved in PHA synthesis in the bacterium Aneurinibacillus sp. AFn2 on different types of production media. The presence of selected genes was verified using classical PCR. After that the cultivation experiments were performed on mineral and complex media to simulate environments with different nutrient availability. Biomass concentration was determined gravimetrically from the samples collected in time during the growth curve measurement. PHA content was measured simultaneously using gas chromatography. Finally, the expression of the studied genes was analysed by RTqPCR. Significant differences were observed in the transcription of individual genes depending on the media type and time. The results confirmed the ability of Aneurinibacillussp.AFn2 to produce PHA independently on nutrient limitation, however, the production rate and cell filling depended on the media type. This fact may be related to the different course of expressed genes involved in PHA synthesis. A higher percentual yield of P(3HB) in cells were observed in complex media along with an increasing trend in the overall gene expression. On the other hand, in mineral medium, the transcription of individual genes only decreased after initial strong expression, and the cell filling of P(3HB) was also lower. The findings lead to understanding not only the expression of selected genes but also the overall synthesis of PHA. At the same time, it offers the way to optimize production with the aim of reducing cost and expanding their market applications.
Polyhydroxyalkanoates are microbial storage polymers that represent a green alternative to petrochemical plastics. However, their high production cost limits wider industrial utilization. Use of waste materials as a substrate and/or utilization of extremophilic organisms is an option to reduce production costs. The strain of thermophilic bacteria Aneurinibacillus appears to be a promising producer because of its ability to synthesize wide range of non traditional copolymers. In addition, PHA synthesis is independent of nutrient limitation, which was the subject of this study. Experiments were focused on the expression of genes involved in PHA synthesis in the bacterium Aneurinibacillus sp. AFn2 on different types of production media. The presence of selected genes was verified using classical PCR. After that the cultivation experiments were performed on mineral and complex media to simulate environments with different nutrient availability. Biomass concentration was determined gravimetrically from the samples collected in time during the growth curve measurement. PHA content was measured simultaneously using gas chromatography. Finally, the expression of the studied genes was analysed by RTqPCR. Significant differences were observed in the transcription of individual genes depending on the media type and time. The results confirmed the ability of Aneurinibacillussp.AFn2 to produce PHA independently on nutrient limitation, however, the production rate and cell filling depended on the media type. This fact may be related to the different course of expressed genes involved in PHA synthesis. A higher percentual yield of P(3HB) in cells were observed in complex media along with an increasing trend in the overall gene expression. On the other hand, in mineral medium, the transcription of individual genes only decreased after initial strong expression, and the cell filling of P(3HB) was also lower. The findings lead to understanding not only the expression of selected genes but also the overall synthesis of PHA. At the same time, it offers the way to optimize production with the aim of reducing cost and expanding their market applications.
Description
Citation
DVOŘÁKOVÁ, D. Využití molekulárních technik při studiu termofilních mikroorganismů [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2024.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
cs
Study field
Biochemická technologie
Comittee
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (místopředseda)
prof. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (člen)
prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D. (člen)
doc. RNDr. Renata Mikulíková, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
Date of acceptance
2024-06-12
Defence
1. Studentka seznámila členy komise s náplní a cílem bakalářské práce.
2. Byly přečteny posudky na bakalářskou práci.
3. Studentka akceptovala všechny připomínky oponentky a na všechny otázky odpověděla v plné šíři.
Diskuse:
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc.
S jakými metabolickými drahami Vámi zkoumané geny souvisejí? Můžete na základě měření genové exprese říct něco o aktivitě výsledných enzymů?
Souvisí tedy nějak míra exprese Vámi zkoumaných genů na použitém médium? Zjistili jste tedy nějakou souvislost s produkci PHA?
prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.
V jakém kultivačním médium byla naměřena vyšší exprese zkoumaných genů? Kontrolovala jste kvalitu RNA pomocí elektroforézy? Jakými způsoby je možné detekovat nukleové kyseliny? Jaké jsou další metody?
Studentka odpověděla na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. V diskusi studentka prokázala výbornou orientaci v dané problematice. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Studentka prokázala nejen výborné odborné znalosti, ale i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení