Vytipování a sledování exprese genů ovlivňujících syntézu kyseliny hyaluronové ve streptococcus equi subsp. zooepidemicus pomocí technologie dna čipů a real time PCR
Loading...
Date
Authors
Hrudíková, Radka
ORCID
Advisor
Referee
Mark
P
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Kyselina hyaluronová (HA) je biologicky významnou látkou, která je využívána v potravinářském, farmaceutickém a především kosmetickém průmyslu. Jde o glykos- aminoglykan běžně se vyskytující v lidském těle. Jako jeden z virulentních faktorů ji některé bakteriální kmeny produkují ve formě kapsule. Obaluje bakteriální buňku za účelem ochrany před imunitním systémem napadeného organismu. Jedním z hlavních producentů je Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Tato Gram-pozitivní bakterie je využívána ve společnosti Contipro a.s. k výrobě HA. Produkční kmen CO4A byl získán náhodnou fyzikální mutagenezí. Cílem této práce bylo prostudovat změny v genomu a transkriptomu kmene, které vedly k významnému navýšení produkce HA. Genom kmene CO4A byl osekvenován a porovnán s referenčním kmenem ATCC35246 [1]. Velikost genomu je 2 167 251 bp a bylo v něm identifikováno 83 relevantních variant (59 SNV a 34 indelů). Varianty v kódujících oblastech byly anotovány a byly také určeny změny aminokyselinové sekvence. U SNV mutací došlo ke změně aminokyselinové sekvence v 45 případech, u indel mutací byla změna aminokyselinové sekvence identifikována vždy. U obou kmenů byla sledována míra exprese vybraných skupin genů metodou DNA čipů. U kmene CO4A byla pozorována kaskáda zvýšené míry exprese genů metabolismu aminocukrů, vedoucí k syntéze UDP-N-acetylglukosaminu (navýšení exprese u těchto genů v porovnání s ATCC35246 bylo v průměru o 28 %). Následně byla míra exprese vybraných genů ověřována real-time PCR (qPCR). Zde nebyl identifikován signifikantní rozdíl míry exprese u genů has operonu u obou kmenů. Metodou qPCR byl sledován také vliv suplementace kultivačního média N-acetylgukosaminem (GlcNAc), který je jedním z prekurzorů syntézy HA. Byl zaznamenán pozitivní vliv suplementace kultivačního média externím GlcNAc na expresi vybraných skupin genů a také na výtěžek HA z média po ukončení kultivace u kmene CO4A (nárůst výtěžku v průměru o 17 %). U kmene ATCC35246 byl sledován pozitivní vliv na výtěžek HA z kultivací (nárůst výtěžku v průměru o 9 %), ale nebyla zjištěna signifikantní změna míry exprese u vybraných skupin genů.
Hyaluronic acid (HA) is an important substance, which is mostly used in pharmaceutical and cosmetic industry. This substance is commonly found in the human body. HA is one of the factors contributing to virulence of microorganisms. Some bacterial strains produce hyaluronic acid in the form of a mucoid capsule that encapsulates the cell to protect bacteria against the immune system of the host organism. One of the main producers is the bacterial strain Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Contipro a.s. uses the strain CO4A to produce hyaluronic acid in large scale. The production strain was obtained by random mutagenesis by UV light. The aim of the work was to study changes in the genome, which led to a significant increase in hyaluronic acid production, using DNA microarray and real-time PCR (qPCR). The genome of the strain CO4A was sequenced and compared to reference ATCC35246 [1]. The size of the genome is 2,167,251 bp and 83 relevant variants (59 SNV and 34 indels) have been identified. Variants in coding regions were annotated and amino acid sequence changes were determined. In SNV mutations there was a change in the amino acid sequence in 45 cases. The change was identified in every case of indel mutations. The expression level of selected groups of genes was monitored in both strains by the method of DNA microarrays. A cascade of increased expression level of amino sugar metabolism genes leading to the synthesis of UDP-N-acetyl glucosamine was observed in strain CO4A (the increase in expression level of these genes compared to ATCC35246 was on average 28 %). Subsequently, the expression of selected genes was verified by qPCR. There was no significant difference in the expression level of the has operon genes of both strains. The effect of supplementation of the culture medium with N-acetylglucosamine (GlcNAc), which is one of the precursors of HA synthesis, was also studied by qPCR. A positive effect of the supplementation of the culture medium with external GlcNAc in the CO4A strain has been recorded. Also, the supplementation has positive effect on the yield of HA from the medium (increase in yield was on average by 17 %). GlcNAc has been shown to have a positive effect on the yield of HA in ATCC35246 strain as well (increase in yield was 9 % on average), but no significant changes in the expression levels were found in selected groups of genes in ATCC35246.
Hyaluronic acid (HA) is an important substance, which is mostly used in pharmaceutical and cosmetic industry. This substance is commonly found in the human body. HA is one of the factors contributing to virulence of microorganisms. Some bacterial strains produce hyaluronic acid in the form of a mucoid capsule that encapsulates the cell to protect bacteria against the immune system of the host organism. One of the main producers is the bacterial strain Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Contipro a.s. uses the strain CO4A to produce hyaluronic acid in large scale. The production strain was obtained by random mutagenesis by UV light. The aim of the work was to study changes in the genome, which led to a significant increase in hyaluronic acid production, using DNA microarray and real-time PCR (qPCR). The genome of the strain CO4A was sequenced and compared to reference ATCC35246 [1]. The size of the genome is 2,167,251 bp and 83 relevant variants (59 SNV and 34 indels) have been identified. Variants in coding regions were annotated and amino acid sequence changes were determined. In SNV mutations there was a change in the amino acid sequence in 45 cases. The change was identified in every case of indel mutations. The expression level of selected groups of genes was monitored in both strains by the method of DNA microarrays. A cascade of increased expression level of amino sugar metabolism genes leading to the synthesis of UDP-N-acetyl glucosamine was observed in strain CO4A (the increase in expression level of these genes compared to ATCC35246 was on average 28 %). Subsequently, the expression of selected genes was verified by qPCR. There was no significant difference in the expression level of the has operon genes of both strains. The effect of supplementation of the culture medium with N-acetylglucosamine (GlcNAc), which is one of the precursors of HA synthesis, was also studied by qPCR. A positive effect of the supplementation of the culture medium with external GlcNAc in the CO4A strain has been recorded. Also, the supplementation has positive effect on the yield of HA from the medium (increase in yield was on average by 17 %). GlcNAc has been shown to have a positive effect on the yield of HA in ATCC35246 strain as well (increase in yield was 9 % on average), but no significant changes in the expression levels were found in selected groups of genes in ATCC35246.
Description
Keywords
kyselina hyaluronová, Streptococcus zooepidemicus, genová exprese, celogenomová sekvenace, DNA čipy, real-time PCR, referenční gen, bioinformatika, regulace exprese genů, hyaluronic acid, Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, gene expression, whole genome sequencing, DNA microarrays, real-time PCR, housekeeping gene, bioinformatics, regulation of gene expression
Citation
HRUDÍKOVÁ, R. Vytipování a sledování exprese genů ovlivňujících syntézu kyseliny hyaluronové ve streptococcus equi subsp. zooepidemicus pomocí technologie dna čipů a real time PCR [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2020.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
cs
Study field
Fyzikální chemie
Comittee
Date of acceptance
2020-09-16
Defence
Předseda komise představil doktorandku. Ing. Hrudíková absolvovala zahraniční stáž v rámci programu Erasmus+ na NTNU v Norsku. Od roku 2012 ma již řadu pracovních zkušeností. V první polovině roku 2013 absolvovala pedagogickou praxi (vedení praktik z biochemie). Účastnila se konferencí v ČR a v zahraničí. Má 2 články v impaktovaných časopisech. Rovněž má podíl na 1 patentu.
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení