Využití fluorescenčních technik k analýze průmyslově významných mikroorganismů

Simple item page
but.committeeprof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda) doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen) prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D. (člen) prof. Ing. Stanislav Kráčmar, DrSc. (člen) doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen) prof. RNDr. František Krčma, Ph.D. (člen) prof. RNDr. Jaroslav Turánek, CSc. (člen) Mgr. Alena Sýkorová (člen)cs
but.defencePředsedkyně komise představila doktorandku a předala jí slovo. Ing. Müllerová má již řadu pracovních zkušeností. V letech 2016 - 2018 se účastnila konferencí v Brně, Mikulově a Krakowě. V akad. roce 2018/2019 absolvovala stáž na univerzitě v Lundu. Je spoluautorkou několika publikací a posterů. Ve své powerpointové prezentaci představila doktorandka podstatné výsledky své disertační práce. Byly přečteny oponentské posudky. Oba kladné a doporučovaly práci k obhajobě, obsahovaly však celou řadu připomínek a také dotazů, na které doktorandka odpověděla uspokojivě. Následovala diskuze, do které se zapojili i ostatní členové komise. Konkrétní dotazy jsou na přiložených lístcích, které se archivují.cs
but.jazykangličtina (English)
but.programChemie a technologie potravincs
but.resultpráce byla úspěšně obhájenacs
dc.contributor.advisorObruča, Stanislaven
dc.contributor.authorMüllerová, Lucieen
dc.contributor.refereeKráčmar, Stanislaven
dc.contributor.refereeKrčma, Františeken
dc.date.accessioned2023-06-08T06:56:57Z
dc.date.available2023-06-08T06:56:57Z
dc.date.created2023cs
dc.description.abstractTechniky analýzy jednotlivých buněk neboli single-cell analýzy, jsou velmi důležité v kontextu studia důležitých biotechnologických mikroorganismů. V biotechnologických procesech je optimální mít rychlé, efektivní a real-time analýzy, které lze provést s minimální přípravou vzorku. Proto jsme v rámci předložené disertační práce využili autofluorescenci jako marker fyziologického stavu mikrobiální kultury, který je možné analyzovat pomocí fluorescenční mikroskopie a/nebo průtokové cytometrie. Nejdříve bylo potvrzeno, na základně emisních spekter, že zelená autofluorescence emitovaná bakteriemi Cupriavidus necator H16 a jejím polyhydroxyalkanoáty (PHA) neprodukujícím mutantem Cupriavidus necator PHB-4, pochází skutečně z flavinů. Emisní maximum bylo naměřeno v rozmezí 510–550 nm pro FAD, FMN a riboflavin – bohužel jednotlivá spektra od sebe nebylo možné rozeznat, a 515 nm pro oba bakteriální kmeny Cupriavidus necator. Byly nalezeny dvě maxima excitačních spekter, jedno v rozmezí 360–370 nm a druhé okolo 440 nm. Z těchto poznatků byl sestaven nový protokol pro fluorescenční mikroskopii – laser byl nastaven na hodnotu 467 nm a emisní filtr pro detekci byl vybrán 520/35 nm. Flaviny a jejich autofluorescence může být take použita v kombinaci s jinými fluorofory, když jsou použity multiparametrické analýzy, ale je důrazně doporučeno, aby vybrané fluorescenční sondy buď emitovaly v jiném rozmezí, než je 500–550 nm anebo byla jejich doba života excitovaného stavu jiná, než je interval 3,2–3,7 a 4,2 – 4,9 ns. Tyto doby života navíc zůstaly konstantní, i když byly buňky vystaveny kultivačním a stresovým podmínkám. To z nich dělá velmi stabilní marker v porovnání s dynamickým charakterem intenzit fluorescence. Dále byl optimalizován protokol pro značení bakterie C. necator s využitím PHA specifické sondy BODIPY 493/503. Optimální koncentrace této lipofilní sondy byla stanovena na 2,5 µg ml-1 a sondu je možné dle našich dat aplikovat společně s viabilitní sondou propidium iodidem. Tento protokol byl také využit pro studium morfologie PHA-syntetizující halofilní bakterie Halomonas halophila. Pro stanovení UV-protektivních vlastností PHA obsaženého v bakterii Cupriavidus necator, byl optimalizován další protokol, tentokrát pro ROS citlivou sondu CM-H2DCFDA, která byla stanovená jako citlivější v porovnání s její nemethylovanou formou. V této studii byly navíc potvrzeny UV-protektivní vlastnosti PHA na bakterii Cupriavidus necator H16 v porovnání s PHA nesyntetizujícím kmenem Cupriavidus necator PHB-4.en
dc.description.abstractSingle-cell analysis techniques are very important when studying relevant biotechnological microorganisms. In biotechnological processes, the optimum is to have fast, efficient and real-time analyses that can be done with minimal preparations. Therefore, we looked at autofluorescence as a possible and natural marker when employing fluorescence microscopy and flow cytometry. First, it has been established, based on the emission spectra, that the green autofluorescence of the bacteria used – Cupriavidus necator H16 and its non polyhydroxyalkanoates (PHA) producing mutant Cupriavidus necator PHB-4, is caused predominantly by flavins. The maxima of emission spectra were 510 – 550 nm for FAD, FMN and riboflavin whose spectra could not be distinguished, and 515 nm for both strains of Cupriavidus necator. Two maxima of excitation spectra of the bacteria were found – one in the range 360 – 370 nm and another around 440 nm, and so a new protocol for fluorescence microscopy has been established - the laser used was 467 nm and the emission filter chosen for the detection was 520/35 nm. Flavins and their autofluorescence can also be used in combination with other fluorophores when the need for multi-parametrical analyses arises, but it’s highly recommended the other dyes emit other than green fluorescence in the band of 500 – 550 nm or/and have an average fluorescence lifetime other than 3.2 – 3.7 and 4.2 - 4.9 ns. These values stayed constant even when the cells were exposed to various cultivation and even stress conditions. That makes them a very stable marker compared to the dynamic marker of fluorescence intensity that changes immediately after a change in the environment. A new staining protocol for C. necator using PHA-specific hydrophobic probe BODIPY 493/503 was optimised. The optimal staining concentration of the lipophilic dye BODIPY 493/503 was determined to be 2.5 µg ml-1 and it can be used in combination with propidium iodide. The BODIPY 493/503 staining protocol has been used when analysing the morphology of the PHA-synthesising bacteria Halomonas halophila. Further, to study the UV-protective properties of PHA in Cupriavidus necator, another staining essay has been optimised. It has been established that the ROS sensitive dye CM-H2DCFDA gives better performance than its non-methylated form. Also, the UV-protective characteristics of the PHA-synthesising strain Cupriavidus necator H16 were confirmed when compared to its non-PHA synthesising strain C. necator PHB-4.cs
dc.description.markPcs
dc.identifier.citationMÜLLEROVÁ, L. Využití fluorescenčních technik k analýze průmyslově významných mikroorganismů [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2023.cs
dc.identifier.other152849cs
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11012/210152
dc.language.isoencs
dc.publisherVysoké učení technické v Brně. Fakulta chemickács
dc.rightsStandardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezenícs
dc.subjectBakteriální autofluorescenceen
dc.subjectCupriavidus necatoren
dc.subjectSporomusa ovataen
dc.subjectHalomonas halophilaen
dc.subjectanalýzy jedné buňkyen
dc.subjectdoba života excitovaného stavuen
dc.subjectoxidativní stressen
dc.subjectROSen
dc.subjectkvalita kontroly biotechnologických procesůen
dc.subjectprotektivní charakteristiky PHBen
dc.subjectprůtoková cytometrieen
dc.subjectfluorescenční mikroskopieen
dc.subjectoptimalizace fluorescenčního barveníen
dc.subjectBacterial autofluorescencecs
dc.subjectCupriavidus necatorcs
dc.subjectSporomusa ovatacs
dc.subjectHalomonas halophilacs
dc.subjectsingle cell analysiscs
dc.subjectaverage fluorescence lifetimecs
dc.subjectoxidative stresscs
dc.subjectROScs
dc.subjectbiotechnological processes quality controlcs
dc.subjectPHB protective characteristicscs
dc.subjectflow cytometrycs
dc.subjectfluorescence microscopycs
dc.subjectfluorescence stain optimisationcs
dc.titleVyužití fluorescenčních technik k analýze průmyslově významných mikroorganismůen
dc.title.alternativeUtilisation of fluorescence techniques for analysis of industrially relevant microorganismscs
dc.typeTextcs
dc.type.driverdoctoralThesisen
dc.type.evskpdizertační prácecs
dcterms.dateAccepted2023-06-07cs
dcterms.modified2023-06-07-11:29:01cs
eprints.affiliatedInstitution.facultyFakulta chemickács
sync.item.dbid152849en
sync.item.dbtypeZPen
sync.item.insts2023.06.08 08:56:56en
sync.item.modts2023.06.08 08:12:38en
thesis.disciplinePotravinářská chemiecs
thesis.grantorVysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. Ústav chemie potravin a biotechnologiícs
thesis.levelDoktorskýcs
thesis.namePh.D.cs
Files
Original bundle
Now showing 1 - 3 of 3
Thumbnail Image
Name:
final-thesis.pdf
Size:
13.54 MB
Format:
Adobe Portable Document Format
Description:
final-thesis.pdf
Download
Thumbnail Image
Name:
thesis-1.pdf
Size:
2.27 MB
Format:
Adobe Portable Document Format
Description:
thesis-1.pdf
Download
Thumbnail Image
Name:
review_152849.html
Size:
23.18 KB
Format:
Hypertext Markup Language
Description:
review_152849.html
Download
Collections
2023