Vypracování a zavedení metodiky na stanovení osových proteinů

Abstract

Osový protein agrekanu má významný podíl na správnou funkci kloubní chrupavky. Jeho nedostatek nebo strukturální porušení může být příčinou její nedostatečné funkce. Pro studium produkce agrekanu byla použita kultura chondrocytů získaná z vepřové kloubní chrupavky. Jednovrstevná kultivační metoda poskytuje modelový systém, který umožnil sledovat produkci agrekanu do růstového média. Syntéza agrekanu byla v médiu stimulována přídavkem L-methioninu, L-serinu a seleničitanu sodného pentahydrátu. Methionin a serin jsou prekurzory sirné aminokyseliny cysteinu, jejíž role je pro správnou funkci osového proteinu nezastupitelná. Zvýšený obsah cysteinu by mohl nasvědčovat zvýšené produkci osového proteinu. Růstová média a chondrocyty byly po kyselé nebo oxidativní hydrolýze analyzovány pomocí automatického analyzátoru aminokyselin. Analýzou bylo určeno aminokyselinové zastoupení. Hlavní pozornost byla věnována cysteinu. Měnící se koncentrace této aminokyseliny nám ukazovala, zda jsou prekurzory v přídavku využity na její tvorbu a tedy zda je možné těmito prekurzory produkci osového proteinu stimulovat. Výsledky jsou diskutovány v závěru práce. Dalším krokem by mělo být zjištění koncentrace syntetizovaného agrekanu imunologickou metodou. V současné době je tato metoda finančně velmi náročná, proto byla zvolena pro první orientační testy metoda stanovení produkce osového proteinu agrekanu pomocí vhodné aminokyseliny.Core protein of aggrecan has a significant share on the correct function of articular cartilage. Its lack or structural failure could be the reason for the disfunction of the cartilage. The culture of chondrocytes taken from a pork articular cartilage was used for the study of aggrecan production. The monolayer culture method offers the model system which has enabled us to watch the aggrecan production into growth medium. The aggrecan synthesis was stimulated in the media with addition of L-methionin, L-serin and sodium selenite pentahydrate. Methionin and serin are antecedents of sulphur amino acid of cysteine, whose role is incredibly important for the correct function of core protein. Growth media and chondrocytes were analysed with the help of the automatic amino acids analyzer unit after acid or oxidative hydrolysis. The analyse established the amino acid representation. The main attention was paid to cysteine. The changing concentrations of this amino acid were showing if the antecedents in the addition are used for its production and, therefore, if it is possible to stimulate the production of core protein with these antecedents. The results are discussed in the conclusion of this thesis. The next step should be the detection of the concentration of synthesized aggrecan by the immunological method. Presently this method is very expensive. Therefore, the method of setting the core protein of aggrecan with the help of suitable amino acid was used for the first tests.