ONDREJKOVÁ, M. Použití PCR v reálném čase pro charakterizaci nosičů používaných pro izolaci DNA [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2017.

Posudek vedoucího

Trachtová, Štěpánka

Práce je zaměřena na ověření možnosti využití metody polymerázové řetězové reakce v reálném čase za účelem posouzení úrovně enkapsulace magnetických jader nano- a mikročástic vhodných pro aplikace v molekulární diagnostice, zejména pro izolaci DNA z různých typů komplexních vzorků. Cílem je posouzení funkčnosti částic s ohledem na kvalitu pokrytí jejich magnetických jader vybraným polymerem a tedy schopnosti negativně ovlivňovat syntézu DNA. V rámci praktické části práce byl sledován vliv šesti vybraných typů magnetických částic na amplifikaci DNA v průběhu qPCR. Z výsledků bylo usuzováno na úroveň pokrytí magnetických jader použitým polymerem, kterým byl P(HEMA-co-GMA). V rámci diskuze studentka posoudila dosažené výsledky s ohledem na několik základních parametrů charakterizujících testované magnetické částice (hmotnostní podíl Fe v jádře, index polydispersity, pokrytí povrchu nosiče –COOH skupinami). Studentka přistupovala k řešení práce aktivně a v průběhu řešení prokázala zejména schopnost pracovat samostatně, a to jak při plánování jednotlivých experimentů, tak i při následném vyhodnocování dosažených výsledků. Prokázala organizační schopnosti i orientaci v dané problematice a schopnost pracovat s aktuální odbornou literaturou. Velmi oceňuji schopnost samostatné práce při provádění experimentů, navrhování možností řešení vzniklých problémů a jejich uvádění do praxe. Současně pozitivně hodnotím i práci se získanými daty, jejich interpretaci a diskuzi. Přístup studentky hodnotím pozitivně a vzhledem k tomu, že všechny cíle uvedené v zadání diplomové práce byly splněny, doporučuji práci k obhajobě a hodnotím ji známkou velmi dobře/B.

Posudek oponenta

Šálek, Petr

Předložená diplomová práce autorky Bc. Martiny Ondrejkové se zabývá tématem PCR v reálném čase pro charakterizaci magnetických polymerních nosičů používaných pro izolaci DNA. Předložená práce je členěna standardním způsobem a je zřejmé, že diplomantka vynaložila velké úsilí pro její vytvoření a osvojila si hned několik biologických metod a postupů. Před uvedením mých připomínek - věcných i formálních - bych chtěl napsat, že rozhodně nemají za cíl snížit význam předložené práce a jsou psány v duchu doporučení, pakliže se třeba studentka rozhodne pokračovat v doktorském studiu. Teoretická část je věnována popisu problematiky diplomové práce, kde na začátku autorka velmi obsáhle popisuje magnetické polymerní nosiče a jejich využití v biotechnologiích a biomedicíně. Některé části jsou obsahově srovnatelné s dizertačními pracemi. Pakliže se autorka rozhodla pro až takovou rozsáhlost, jsou některé podkapitoly málo konkrétní a zasluhovaly by detailnější popis problematiky (materiály používané na enkapsulaci a metody přípravy magnetických nosičů). Obecně autorka ve své práci využívá termín enkapsulace, který není v tomto případě vhodný. Znamená totiž něco jiného. V případě částic využitých v práci se jedná se o zapolymerizování magnetických nanočástic. Po části o magnetických polymerních částicích navazuje teoretický popis PCR v reálném čase, který mi přijde v porovnání s předchozí částí chudší. Očekával bych detailnější teoretický popis metody a hlubší rešerši s větším využití zahraniční literatury (review, články). Už jen z toho důvodu, že práce byla vyhotovena na biologickém pracovišti. Na str. 14 se autorka zmiňuje o nutnosti snížení nespecifické sorpce a uvádí to na příkladu jedné publikace (ref. 23), která není ani aktuální (rok publikování 1982) a ani tolik nesouvisí s tématem diplomové práce. Problém nespecifické sorpce je mnohem složitější a komplexnější, než je v práci nastíněno. Ve Vašem případě bych se spíše zaměřil na prostudování nespecifické sorpce při izolaci biologicky aktivních látek. Na str. 15 autorka vysvětluje oxidaci hydroxylových skupin částic na karboxylové skupiny. Při těchto reakčních podmínkách dochází také k hydrolýze oxiranového kruhu u GMA a následné oxidaci na karboxy skupiny. Na str. 19 autorka uvedla chybné pojmenování veličin charakterizujících částice. Veličina Dn je číselně vážená hodnota průměrné velikosti částic a Dw je hmotnostně vážená hodnota průměrné velikosti částic. Autorce doporučuji jednotný jazyk popisu obrázků (viz str. 23). Experimentální část práce obsahuje velký objem získaných dat a autorce se podařilo naměřené údaje předložit ve velmi přehledné formě. Na str. 33, 34, 42 a 43 uvádí autorka různé křivky. Formátování stran je nepovedené a pro čtenáře velmi matoucí. Dává to dojem popisu obrázku. Na str. 37 autorka vysvětluje hodnoty parametrů kalibračních přímek pro mag. nosič Fkol 71. Neměl by to být Fkol 72, když je Tab. 6 pro Fkol 72? Nedošlo na str. 44 u obr. 17A k chybnému popisu rozděleného DNA standardu? Na pár stranách (37, 39, 41) autorka vysvětluje odchylky měření nesprávným pipetováním. Dovolil bych si poznamenat, že by se to v práci nemělo vyskytovat a chyba měla být napravena opakováním měření. Obdobným způsobem se autorka snaží vysvětlit další odchylky způsobené nepřesným přídavkem magnetických nosičů z důvodu sedimentace (např. 37, 38). Opět jde o chybu, kterou lze eliminovat. Autorka v několika částech experimentální části píše, že různé nosiče měly vliv na intenzitu fluorescence (např. str. 33, 34). Nicméně z textu není jasné, o jaký konkrétní vliv se jednalo (např. pozitivní, negativní, atd.). Na str. 55 a v závěru práce píšete, že na fluorescenci má vliv stupeň pokrytí magnetického jádra polymerem. Nicméně v práci postrádám stanovení či určení stupně pokrytí magnetického plniva polymerem. DOTAZY: 1) V předložené práci se autorka odkazuje, že v práci byl testován typ magnetických nosičů viz obr. 1a (viz str. 9). Jak jste toto ověřili? V práci postrádám důkaz tohoto typu kompozitu (např. TEM mikrofotografie řezu částicí). Obecně je známo, že disperzní polymerizací (předpokládám, že touto technikou byly použité nosiče připraveny) lze velmi stěží, takřka vůbec, připravit tento typ částic. Pokud se magnetické polymerní částice připraví, vzniká typ viz obr. 1b, 1d, či jejich kombinace. Skutečná distribuce magnetické plniva v polymerní matrix by mohla mít třeba vliv na zhášení fluorescence, jak píšete na str. 55. 2) Na str. 36 autorka uvádí že: "Pri pohľade na smerodajné odchýlky je zrejmé, že výsledky parametrov kalibračnej priamky boli ovplyvnené nepresným prídavkom magnetických nosičov do PCR zmesi, z dôvodu ich sedimentácie." To stejné na str. 38. Z čeho autorka usuzuje, že je to bylo nepřesným přídavkem magnetických nosičů? 3) Na str. 42 a 43 se autorka zmiňuje o možnosti vypozorovat nespecifické produkty PCR. Z čeho lze v obr. 15 a 16 nespecifické produkty vysledovat? 4) Jak si zdůvodňujete sedimentaci částic? Jak staré jsou používané částice? Brali jste v potaz že, v souvislosti s časem dochází k agregaci částic a někdy i k degradaci samotného polymeru? Právě z tohoto důvodu je nutné mít po určitém čase "čertsvou" várku částic. 5) V celé práci postrádám zásadní informaci o přínosu práce a zdůraznění její důležitosti. Co je tedy přínosem práce, proč je důležitá? Na závěr bych chtěl zkonstatovat, že diplomová práce je kvalitní a diplomantka splnila vytýčený cíl práce, který se ji podařilo velmi zdařile prezentovat v předložené diplomové práci. Diplomovu práci Bc. Martiny Ondrejkové doporučuji k obhajobě.

eVSKP id 94701