Posudky závěrečné kvalifikační práce

Posudek vedoucího

Turánek, Jaroslav

Studentka přistupovala samostatně a aktivně k plnění cílů diplomové práce. Získala zkušenosti z celé řady oborů jako je analýza virové RNA metodou kvantitativní PCR, přípravy liposomů a jejich charakterizace metodami dynamického rozptylu světla, infračervené spektroskopie, a průtokové nanocytometrie. Zvládla také metody povrcové modifikace liposomů technikou klik-chemie pomocí oximové ligace pro navázání polysacharidů a metalochelarační vazby pro navázání rekombinantních antigenů s HIS-Tag kotvou. Výsledky zpracovala přehledně do své diplomové práce a přispěla k řešení komplexního projektu vývoje vakcín a diagnostik pro infekci covid- 19. Zejména její práce na diagnostice virů SARS-CoV-2 je velmi přínosná pro monitorování nákazové situace. Využití své práce nachází v činnosti firmy NEXARS, kde vypracovala svoji diplomovou práci. Práci doporučuji k obhajobě

Dílčí hodnocení
Kritérium	Známka	Body	Slovní hodnocení
Splnění požadavků zadání	A
Studium literatury a její zpracování	A
Využití poznatků z literatury	A
Kvalita zpracování výsledků	A
Interpretace výsledků, jejich diskuse	A
Závěry práce a jejich formulace	A
Využívání konzultací při řešení práce	A
Celkový přístup k řešení úkolů	A

Navrhovaná známka: A

Posudek oponenta

doc. RNDr. Milan Bartoš. Ph.D.

Jedná se v podstatě o dvě diplomové práce spojené objektem zájmu, kterým byl pandemický virus SARS-CoV-2. Každá část by mohla být samostatnou diplomovou prací. To částečně narušuje celkový koncept práce, která ale byla nakonec zpracována kvalitně a výsledný dojem je výborný, inspirativní a práce může být východiskem pro další studie. Některé části mohou být považovány za originální. Zadání práce bylo splněno. 1) V Teoretické části se studentka potýkala s formulováním procesu PCR, který byl už tolikrát popsán, že je nesnadné vymyslet vlastní věty, aby student nebyl osočen z plagiátorství. Text v této části působí poněkud nekonzistentně, formulace, že PCR je "samozásobovací" je úsměvný. Ale věcně je pasáž, respektive celá kapitola 2.1 v pořádku. 2) Kapitolu 2.1.5 Princip metody by bylo vhodné přeformulovat, např. 2.1.5 Metoda detekce viru SARS-CoV-2, protože to takto formulované vypadá, že bude osvětlován princip RT-PCR, což už bylo provedeno v odstavcích předchozích. Podobně pro kapitolu 2.1.6. 3) V části popisující lipozómy se studentka pokusila stručně a jasně shrnout rozsáhlou komplikovanou problematiku přípravy a charakterizace lipozómů, což se jí víceméně podařilo. 4) Některé formulace v části Lipozómy jsou ale nepřesné a zavádějící: např. na str. 14 se píše "Všeobecně platí, že pokud je naměřený Zeta potenciál větší než 30 mV (respektive menší než 30 mV) považuje se liposomální koloidní systém za stabilní." nebo na straně 14 se hovoří o biologické stabilitě, která pak není vysvětlena, ale naopak se hovoří o sterické stabilitě (str. 15). 5) Obrázek číslo 2: Princip průtokové cytometrie na str. 22 je nadbytečný, když k ostatním metodám nejsou. Není jasné, proč byla graficky znázorněna právě tato metoda. 6) V části Modifikace liposomů (str. 24) by bylo vhodné definovat, že RBD je doména viru SARS-CoV-2, respektive koronavirů, aby text plynule přešel z obecných formulací ke konkrétní náplni diplomové práce. Z textu to vyčíst lze, ale ten přechod je příliš prudký a šlo to objasnit a vyřešit jedním, dvěma slovy. 7) V experimentální části jsou popsány všechny použité chemikálie, biologický materiál i použité přístroje. Chybí definování výrobce odběrové sady Bi-VoV™ (str. 26). U některých přístrojů se mění označení v seznamu a v textu: Zetasizer Ultra x Zetasizer Nano, NanoFCM analyzer x Nanoanalyzer NanoFCM (str. 27, 28). Chybí specifikace přístroje "laser MALDS", str. 28. Jinak jsou v textu jen drobné nepřesnosti, které věcnou podstatu popisu použitých metod nijak nesnižují. 8) Část Výsledky a diskuse je rozsáhlá a podrobná, dostačující pro tento typ prací. Část zabývající se diagnostikou viru SARS-CoV-2 je diskutována ve všech částech podrobně. Chybí pouze odkazy na literární zdroje, což je ale vzhledem k aktuálnosti tématu velmi komplikované, byly by to pravděpodobně novinové články než zdroje odborné. Nejvíce patrné je to v části 4.1.3 Určení typu mutace, kde se studentka zabývá šířením jednotlivých variant SARS-CoV-2 v čase. Za velmi hodnotnou považuji část, kde se studentka zabývá experimenty s biologickými stěry (kapitola 4.1.2.). Toto je důležitá součást diagnostiky, kterou ovšem většina laboratoří zanedbává. A právě v době hysterie spojené s pandemií SARS-CoV-2 byly metody správné laboratorní praxe ignorovány a vyšetření dělal kdekdo; a takovými testy se málokdo zabýval. Samozřejmě by bylo správné provést testy na větším počtu vzorků, což by ale mohla být samostatná diplomová práce. Část zabývající se lipozómy je méně obsáhlá, ale obsahuje podstatné informace, kterými je naplněn předepsaný obsah diplomové práce. Studentka musela zvládnout práci na poměrně složitých přístrojích, čímž nepochybně získala znalosti a praktické dovednosti, které může využít ve svém dalším profesním růstu. 9) Co se týče části 4.1 Diagnostika viru SARS-CoV-2, bylo by vhodné uvést tabulky s konkrétními hodnotami Ct pro jednotlivé kanály, prezentované grafy jsou jen ilustrační. To platí pro všechny části této kapitoly. Pro srovnání výsledků u různých kitů je to zásadní. Výjimkou je tabulka číslo 8. 10) Otázkou je, jestli je nutné tajit v diplomové práci jména výrobců jednotlivých kitů. 11) Namísto označení jednotného čísla "vir", prezentovaného našimi tradičně nevzdělanými masmédii a politiky, je třeba používat správného termínu "virus". 12) Obrázek č. 15 patří do části "Metody", je na něm uveden profil RT-PCR reakce. 13) V kapitole 4.1.2. Experimenty s biologickými stěry chybí uvedení, kterou metodou byly testy provedeny. 14) Kapitoly týkající se lipozómů by měly být odděleny samostatně jako kapitola 4.2. Z uvedených dat vyplývá, že se studentce podařilo navázat protein RBD na lipozómy, což potvrdila výsledky měření na dvou přístrojích, a to měření DLS prostřednictvím Zetasiser Nano i Nanoanalyzerem Nano FCM. V této části by bylo vhodné opatřit komentáře příslušnými odkazy, jinak je text značně komplikovaný (např. na str. 54 se píše "Nejdřív byla vytvořena kalibrační křivka pro velikost a počet částic.", ale odkaz na doložený Obrázek číslo 46 chybí). Rovněž je diskuse, tak jako v části PCR, prosta literárních odkazů.

Dílčí hodnocení
Kritérium	Známka	Body	Slovní hodnocení
Splnění požadavků zadání	A
Logické členění práce	A
Kvalita zpracování výsledků	B
Interpretace výsledků, jejich diskuse	A
Využití literatury a její citace	B
Úroveň jazykového zpracování	B
Formální úroveň práce – celkový dojem	A
Závěry práce a jejich formulace	A

Navrhovaná známka: A

Otázky

1) V práci na straně 8 uvádíte, že přesnost a kvalita výsledků je v případě izolace virové RNA mnohem vyšší. Mohla byste rozvést, jaké jsou zásadní výhody a nevýhody izolace oproti postupu bezizolačnímu? Jak mohou být ovlivněny výsledky detekce virové RNA v případě, že tato není z biologického materiálu izolována a purifikována?
2) Nerozumím větě na str. 9: "Teplota v termocykleru je oproti hybridizaci trochu vyšší, nicméně nedosahuje hodnoty teploty denaturace." Můžete objasnit, co jste tím myslela? Co je to vlastně teplota denaturace a jak souvisí s běžně používanou hodnotou Tm?
3) V kapitole 2.1.5, str. 11 chybí vysvětlení mutace ERC, ke kterému genu se vztahuje?
4) Na str. 14 uvádíte, že lipozómy "se svou velikostí často klasifikují jako nanostruktury". Od jaké velikosti vlastně se obecně hovoří o nanostrukturách či nanotechnologiích?
5) Na str. 14 píšete: "Všeobecně platí, že pokud je naměřený Zeta potenciál větší než 30 mV (respektive menší než 30 mV) považuje se liposomální koloidní systém za stabilní." Můžete toto tvrzení objasnit?
6) Na straně 14 hovoříte o biologické stabilitě, kterou pak nevysvětlujete, ale naopak hovoříte o sterické stabilitě (str. 15). Jedná se o tytéž procesy?
7) V části Výsledky a diskuse v kapitole 4.1.1 uvádíte srovnání výsledků vyšetření kity od různých výrobců. V části 3.2 Použité metody ale nejsou uvedeny profily RT-PCR reakcí. To měly všechny kity stejné podmínky amplifikace nebo je třeba tuto informaci doplnit?
8) Čím se liší Obrázky č. 36 až 38? Podobně Obrázky č. 39-41. V textu jsem komentář nenašel.