MÜLLEROVÁ, L. Využití fluorescenčních technik k analýze průmyslově významných mikroorganismů [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2023.
Ing. Lucie Müllerová se ve své disertační práci věnovala studiu využití vybraných fluorescenčních technik, především fluorescenční mikroskopie a také průtokové cytometrie, ke studiu průmyslově významných mikroorganismů. Svou disertační práci řešila od září roku 2016 na Ústavu chemie potravin a biotechnologií Fakulty chemické VUT v Brně 2018 a odevzdala ji v březnu roku 2023. Během svého doktorského studia absolvovala studentka všechny dílčí zkoušky a následně úspěšně vykonala státní doktorskou zkoušku. Ve třetím ročníku doktorského studia absolvovala šestiměsíční zahraniční stáž ve skupině prof. Rajni Hatti-Kaul ve švédském Lundu. Následně přestoupila do distanční formy studia. Během presenční části svého doktorského studia se Lucie jako členka řešitelského týmu aktivně zapojila do několika projektů základního výzkumu, ve kterých byla zodpovědná za pokročilé analýzy mikrobiálních buněk s využitím průtokové cytometrie a fluorescenční mikroskopie. Dosažené výsledky byly publikovány formou 3 článků v mezinárodních časopisech s impaktním faktorem, u jedné publikace je disertantka první autorkou a hlavní nositelkou odborné myšlenky, u dalších dvou publikací je pak členkou kolektivu autorů s jednoznačně definovanou rolí, která je vymezena její odborností a zaměřením. K dnešnímu dni (5.6.2023) dosáhly publikační výstupy studentky dle vědecké databáze Scopus úctyhodných 136 citačních ohlasů, což dokládá široký dosah její práce. Kromě publikačních výstupů studentka během svého studia také aktivně presentovala dílčí výsledky svých experimentů na vybraných tuzemských i zahraničních konferencích, za zmínku určitě stojí její vítězství v doktorandské soutěžní sekci konané při konferenci Chemistry and Life 2018. Své nejdůležitější výsledky a závěry shrnula Ing. Lucie Müllerová v anglicky vypracované disertační práci. Za nejvýznamnější lze jistě považovat pasáže věnované analytickému využití autofluorescence buněk k monitoringu biotechnologického procesu a fyziologického stavu mikrobiální kultury. Je možné konstatovat, že Ing. Lucie Müllerová je zralou osobností, která i přes řadu objektivních překážek dokázala během svého doktorského studia dosáhnout řady zajímavých výsledků a i přes nepříznivé okolnosti dokázala splnit všechny své povinnosti a vypracovat a odevzdat disertační práci, která splňuje nároky kladené na tento typ vysokoškolské závěrečné práce. V rámci svého studia prokázala vysokou míru odhodlání, motivace a samostatnosti. Vzhledem k výše uvedeným skutečnostem a v souladu s platnou legislativou doporučuji, aby byla disertační práce přijata k obhajobě a po jejím úspěšném obhájení byla Ing. Lucii Müllerové udělena vědecká hodnost Ph.D.
Oponentský posudek na dizertační práci Ing. Lucie Müllerové UTILISATION OF FLUORESCENCE TECHNIQUES FOR ANALYSIS OF INDUSTRIALLY RELEVANT MICROORGANISMS VYUŽITÍ FLUORESCENČNÍCH TECHNIK K ANALÝZE PRŮMYSLOVĚ VÝZNAMNÝCH MIKROORGANISMŮ Školitel: prof. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. Předložená dizertační práce je psána v jazyce anglickém v rozsahu 145 stran s klasickým členěním, psaná na velmi dobré úrovní jak po stránce jazykové, tak i formální. Součástí dizertační práce jsou jako přílohy (8.2 – 8.4.) 3 skeny vědeckých prací zveřejněných v prestižních vědeckých časopisech, které slouží jako podklad pro sepsání dizertační práce, proto je má funkce oponenta jednodušší, neboť tyto prošly již náročným oponentním řízením. Práce řeší aktuální téma hledající optimální a jednoduché technické analýzy jednotlivých buněk s minimální náročností přípravy vzorku. Abstrakta v jazyce anglickém i českém včetně klíčových slov plně vystihují cíle, metodické postupy, materiál a výsledky práce. Dizertační práce neuvádí její cíle v samostatné kapitole, tyto jsou uvedeny jednak v Anotacích a dále v rozšířeném Úvodu. Po prostudování dizertační práce mohu konstatovat, že stanovené cíle byl naplněny včetně jejich vyhodnocení a prezentace. Úvod (Introduction) velmi podrobně charakterizuje jednotlivé kroky fluorescence jako markeru fyziologického stavu mikrobiální kultury analýzou pomocí fluorescenční mikroskopie nebo průtokové cytometrie, s cílem urychlení analýz, vše dokumentováno vědeckými odkazy jiných autorů. Kapitola nemusela být tak široce pojata. Teoretická část se detailně zabývá analýzou jedné buňky, fluorescenčními metodami, analýzou průtokové cytometrie, fluorescenční mikroskopií, bakteriální fluorescencí, monitorováním bakterií během biotechnologických analýz (oxidačním stresem). Celá kapitola je sepsána přehledně, logicky, plně vystihuje zkoumanou problematiku. Vše je vhodným způsobem doplněno obrázky, grafy a tabulkami. Oceňuji, že autorka v rozsahu celé práce správně uvádí literární zdroje, správné analytické pojmy a hmotnostní vyjádření zkoumaných hodnot. K této části nemám připomínky. Kapitola Materiál a metody uvádí použité mikroorganismy, metodami jejich kultivace včetně složení substrátů (živných půd). Vše bylo provedeno dle platných metodik, přístrojového vybavení pracoviště a praktických zkušenosti řešitelů. Drobné připomínky směřují k recepturám živných půd, je správné vyjádření 1 litru (co nato SI soustava?) destilované vody, když o řádek výše (přídavek stopových prvků) 1 ml, atd. (odkaz na tabulky 3-6), vysvětleno je to až v podkapitole 3.2.1. Bylo by vhodné při ústní prezentaci metod a jejich výsledků doplnit zdroj použitých matematicko-statistických metod výpočtů, popř. statistické programy a systémy řízení a vyhodnocení analýz přístroje, resp. jeho software? Výsledky a diskuze jsou prezentovány srozumitelným textem, doplněny obrázky a tabulkami s patřičným komentářem. Veškerá data jsou správně uvedena, včetně statistických hodnot a akceptace jednotek SI soustavy. Závěry dizertační práce jsou správně interpretovány, vytváří předpoklady pro další zkoumání problematiky, vycházejí z výsledků jednotlivých experimentů a vlastních zkušeností dizertantky. Část dizertační práce věnující se jejímu významu pro praxi a další rozvoj vědního oboru není uvedena, částečně je uvedena v kapitole Závěry? Doporučuji v rámci prezentace dizertační práce při obhajobě, popř. ve všeobecné rozpravě sdělit okruhy problémů, kterými by se nadále mělo vědecká komunita zabývat (např. Využitím různých vlnových délek) a specifikovat závěry pro odbornou i praktickou veřejnost. Seznam použité literatury je tvořen 223 citacemi domácích a zahraničních autorů, v celém rozsahu dizertační práce byly tyto využity. Převážná část zdrojů je citována dle normy ČSN ISO 690, u zdrojů 26,30-32,59,61,63,65,99,100,145,154,210-214 jsou citace neúplné, přestože jsou dostupné veškeré informace pro jejich uvedení. Součástí dizertační práce je Curriculum vitae a Publikační činnost dizertantky, ve kterých prokazuje schopnost samostatně tvořit a vědecky pracovat. I při zpracování těchto částí práce měla být věnována větší pozornost. Závěr Předložená dizertační práce Ing. Lucie Müllerové splňuje po stránce vědecké, obsahové i formální požadavky stanovené příslušnými vyhláškami pro získání vědecko-akademické hodnosti. Na základě uvedeného navrhuji, aby Ing. Lucii Müllerové byla po úspěšné obhajobě udělena vědecko-akademická hodnost Ph.D. ve Studijním programu Chemie a technologie potravin, Studijním oboru Potravinářská chemie. V Brně dne 30.5.2023 prof. Ing. Stanislav Kráčmar, DrSc.
Referee’s report to the dissertation Thesis of Ing. Lucie Müllerová Utilisation of fluorescence techniques for analysis of industrially relevant microorganisms Doctoral Thesis deals on the development and application of fluorescence techniques for analysis of selected microorganisms producing natural biopolymers from polyhydroxyalkanetes group. The main aim was research of autofluorescence as the simple non-destructive natural marker. The fluorescence microscopy and flow cytometry techniques were applied for the autofluorescence qualitative as well as quantitative measurement tools. After the general introduction and motivation for the experimental work, the general review of individual cells fluorescence analyses is given with stress on the autofluorescence. The main techniques are fluorescence microscopy and flow cytometry. The second part of theoretical background deals on the bacterial autofluorescence and ways how to monitor bacteria during biotechnology processes under selected stress factors. The next part gives detailed description of selected microorganisms cultivation in different environments and at given conditions. This is followed by description of flow cytometry experiments using three different staining assays. Finally, the fluorescence spectroscopy experiments description is presented including spectral analysis. The first part of Results deals on the staining procedures optimization. After that, the visualisation of alginate granules using fluorescence microscopy is described. The main parts of Results are focused on the Cupriavidus necator autofluorescence and influence of enhanced oxidative stress. Finally, Conclusions gives short summary of the obtained results and brings some ideas for the future work in the Thesis field. Three published papers are presented as Thesis supplement. In one case L. Müllerová is the first author, in others she is member of the author’s collective. Whole Thesis is well organized and generally clearly written. The obtained results significantly contribute to the current knowledge of autofluorescence spectroscopy applied on naturally formed alginates determination during the biotechnological processing. Unfortunately, Thesis writing level greatly degrades overall feeling from this work and I’m warmly recommending substantial corrections of the manuscript (details see later). Finally, I’m recommending this doctoral Thesis for the defence and after successful procedure I’m recommending to get title Doctor to Lucie Müllerová. I’m supposing that my questions will be successfully answered during the defence. In Brno, 30. 5. 2023 prof. RNDr. František Krčma, Ph.D. Questions 1. Table 3-7 – Cultivation media were prepared by yourself or purchased? 2. p. 40 – was hydrogen peroxide stabilized or not? This can significantly influence all processes. 3. 3.1.6 what spectrometer was used for the spectrometric measurements? And 3.1.7 - what GC-MS system was used and what were analysis conditions including the separation column? 4. What flow cytometer was used? Information should be given before the solutions preparation because some part of information is now repeated for nothing. 5. p. 43 – “Detection canals -SPAD with noise under 100 Cntss-1 were used” – more important information will be signal/noise ratio. What is the real uncertainty of the experimental data? Some results are presented up to 6 digits accuracy, is this real? This is also reflected in Fig. 22 – the blue line approximation is very ambitious. You have not enough points for this. What is uncertainty of the experimental points? Similar problem is more or less general across whole results. 6. p. 46 “concentration was 1 mg µg ml-1” what is true? 7. Fig. 30 – both are for the same emission wavelength. For H16 is at fluorescence maximum, but for the PHB-4 is not at the maximum. How can this influence the data interpretation? 8. p. 63 – is shortest fluorescence real fluorescence? Lifetime of ps scale should reflect something else because this relates to distance of 100 microns so this should be connected to some multireflection of the original laser pulse. Is any information about such short lifetime is literature? And what was the real time resolution of fluorescence signal? 9. Table 11 shows results for 7 different samples. What was difference among samples? Is it simple repetitive measurement, or measurement of different cultures (differing by conditions during cultivation, independent cultivation at quasi same conditions, etc.). This is not clear and results for selected samples are rather different (one order of magnitude in counts, times can differ by 20%, so 7 samples seem be not sufficient number for serious study. Also table quality is not too high. Is it reproduced form anywhere? If yes, citation is missing. 10. p. 71 – singlet is molecular oxygen, not oxide. Hydrogen peroxide doesn’t interact to water but its efficiently dissociated by radiation or catalytically by iron (Fenton reaction). p. 72 was the liquid surface the same for all volumes of flasks? I’m thinking, the more important parameter is ratio of free surface to volume. I’m recommending to try series with different ratio and with the same ratio but different volume. p. 72 – idea for future measurements. Repeat the same experiments with controlled oxygen content above liquid. In general, normal oxygen is non-reactive, so question is origin and concentration of ROS. 11. Figs. 41 and 42 – what are accuracies of the mean values? I’m thinking that more relevant is integral value then mean one because of the used method principle. 12. Fig. 50 It will be much better to use simple graph showing the “mean” values in time to be able to see character of dependence (linear, logarithmic). This should be also useful for all other similar figures. 13. 4.4.2 This part brings simply some experimental data but without any significant discussion. List of other comments 1. Abstract in Czech – language is crying. 2. p. 7 - many naturally synthesised PHAs very discovered [9] and some PHAs were isolated from genetically modified microorganisms [10]. 3. p. 8 “Previous studies proved that the strain Cupriavidus necator H16, PHA producing strain, can defend itself much better from the attack of free radicals when compared to its PHA nonproducing strain Cupriavidus necator PHB-4 [14].” Is not merged in block. 4. P. 10 bottom - but cannon divide, 5. Tab 1 – it was not good idea to merge text into blocks in narrow columns. 6. p. 12 “f Karmann and col. [43] used flow cytometry was to identify two subpopulations ….” 7. p. 12 “PHA granules inside is distributed” 8. p.12 – “Phenomena where light is emitted, are called luminescence.” Is not true. Bulb radiation is luminescence? 9. p. 12 – 13 – description of luminescence principles is not fully correct. The common simplifications are use but it is not fully true. I’m recommending more detailed study of these principles, especially because this is key point of the experimental part of the Thesis. 10. p. 13 “the triplet state is much longer than the singlet state,” how long is state? 11. p. 14 “a marked of cell death” marker 12. Some information is repeated more times within consequent paragraphs. 13. p. 27 – writing quantities with uncertainty 2.3 ± 0.2 nm must be as (2.3 ± 0.2) nm 14. p. 30 “In C. necator, the PHB granules’ surface is covered by six types of” Why this is in smaller font? 15. p. 32 Fig. 14 – reference is missing. 16. p. 35 “H2O2” indexes 17. 3.1.4 – two cross links warnings are in text. 18. Formulation “laser used was 467 nm” is non-correct. Laser used should specify the kind of laser (gaseous, solid state, tunable, dye laser, excimer, …..). The second half is information about operational wavelength. The same laser system can produce more laser transitions. And what was laser power? 19. P. 54 – was really TEM used for the visualisation? The used resolution is more relevant for the SEM. Both techniques are operating under high vacuum’, how were samples prepared? 20. Figs. 28, 29, 30 – tics at both axes are missing. Also more common values for step of 20 nm are 500, 520 ….., not 490, 510,….. Fluorescence intensity has some units. If it is normalized, value is relative. 21. Why format of graphs in Fig. 31 is different with respect to the precedent? It will be better to get all 4 curves into one graph to be able much better see differences/similarities. And Fig. caption must be repeated if figures is continuing over more pages. Were spectra corrected to the background level? It seems be not because minimal signal in all cases is about 3000 counts. Where this originates? 22. Fig. 32 – why style of scale bars is not uniform for all pictures? 23. p.61 – missing reference 24. Figs. 35 and 36 – vertical separation by white lines will be useful for the pictures readability. 25. p. 66 – the first paragraph is in different font. 26. Fig. 39 – vertical separation by white lines will be useful for the picture’s readability. 27. Figs. 43 and 44 Fluorescence mean has no units? And I’m not understanding x-axis. Why it is non-linear and why tics are not linked to numbers? Such graph is non-scientific. What are experimental uncertainties? And why graph format is different from all others? 28. Tables 13 and 14 – How errors were estimated? 29. Fig. 45 – vertical separation by white lines will be useful for the picture’s readability. 30. 4.4.1.2 – what is correct? Fermenter or fermentor? 31. Fig. 46 Again new format. It will be better to use normal linear x-axis. Other comments to graph are the same as before. Hydrogen peroxide was added under 75% of oxygen concentration or oxygen was switched off? 32. Fig. 47 Where y-axis is blowing? And biomass value has no uncertainty? 33. Fig. 48 Non correct labelled tics on y-axis. What is the experimental uncertainty? Why the lowest concentration has the highest effect? I was expecting that effect will be +- directly proportional to hydrogen peroxide concentration. 34. Fig. 49 Besides graphics that should be improved. Color scales seem be the same but interpretation of results based on colors seems be problematic. More exact data will be useful. 35. Fig. 51 The same problems as in nearly all other figures. X-axis title overlaps with tics. 36. Format of references is non-uniform.
eVSKP id 152849