Posudky závěrečné kvalifikační práce

Posudek vedoucího

Obruča, Stanislav

Ve své diplomové práci se Tomáš Opial zaměřil na biotransformaci kyseliny ferulové s využitím termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans. Téma byla řešeno v rámci projektu GAČR. K řešení diplomové práce přistupoval student zodpovědně a s rozvahou. Podílel se na plánování experimentů a získané výsledky pravidelně konzultoval. Při realizaci experimentů prokázal solidní experimentální a laboratorní dovednosti. Na druhou stranu je zapotřebí zmínit poněkud chladný vztah k tématu a neochotu investovat do řešení diplomové práce více osobního zaujetí, které by posunulo výsledky práce od zajímavých k excelentním. Při zpracování samotného textu diplomové práce prokázal student schopnost práce formulovat kvalitní odborný text a přehledně presentovat, komentovat výsledky experimentů a formulovat závěry práce. Jako školitel musím ocenit, že kromě experimentálních dat se studentovi podařilo také zpracovat kapitolu věnovanou metabolismu transformace kyseliny ferulové s využitím základních bioinformatických nástrojů. Poněkud slabší je však práce z pohledu diskuze výsledků v kontextu současného stavu poznání. Celkově jsou výsledky práce velice zajímavé a originální a představují důležitý odrazový můstek pro navazující experimenty. Nicméně se nemohu zbavit pocitu, že snadno mohla být práce o mnoho lepší. Proto práci hodnotím známkou B a doporučuji ji k obhajobě.

Dílčí hodnocení
Kritérium	Známka	Body	Slovní hodnocení
Splnění požadavků zadání	A
Studium literatury a její zpracování	B
Využití poznatků z literatury	B
Kvalita zpracování výsledků	B
Interpretace výsledků, jejich diskuse	B
Závěry práce a jejich formulace	B
Využívání konzultací při řešení práce	A
Celkový přístup k řešení úkolů	B

Navrhovaná známka: B

Posudek oponenta

Dvořák,, Pavel

Předložená diplomová práce se věnuje atraktivnímu a aktuálnímu tématu biotechnologického zpracování a valorizace substrátů (v tomto případě konkrétně kyseliny ferulové a xylózy), které lze získat z nestravitelné složky odpadní rostlinné biomasy – lignocelulózy. Pro účel biotransformace kyseliny ferulové (FA) na průmyslově žádané fenolické látky (kyselinu vanilovou VA, vanilin, či vanilylalkohol VanOH) a konverze xylózy na buněčnou biomasu a polyhydroxyalkanoát P3HB v minerálním médiu využil autor termofilní gram-negativní bakterii Schlegelella thermodepolymerans. Tento organismus je zajímavý pro biotechnologie právě díky své schopnosti efektivně zužitkovat a valorizovat xylózu, druhý nejčastější cukr v lignocelulóze a na planetě Zemi. K práci nemám žádné zásadní výtky. Je psána čtivě (bohužel ale nejsem schopen posoudit gramatickou správnost práce psané ve slovenštině), řazení informací je logické a přehledné. Práce čerpá ze solidních 61 zdrojů. V případě referencí mám menší komentář – svým studentům vždy doporučuji řadit citaci okamžitě po první větě v níž se vyskytne informace z daného zdroje, ne až na konec odstavce. Pakliže jsou všechny zdroje, ze kterých se v daném odstavci čerpalo, zařazeny ve formě citací až na konec odstavce, není jasné, které informace v odstavce pocházejí z kterého zdroje. Podstatné je, že autor splnil zadání práce. Předložil přehlednou literární rešerši, která v úvodu práce shrnuje dosavadní poznatky v oblasti biotransformace FA a umožňuje čtenáři seznámit se s touto problematikou. Dále v experimentální části práce posoudil vliv FA a z ní dovozených fenolických látek na růst S. thermodepolymerans a produkci P3HB a pomocí kultivačních experimentů, analytických technik a částečně i díky závěrečné bioinformatické analýze, nastínil možné metabolické dráhy vedoucí ve vybrané bakterii od FA k žádoucím derivátům VA, VanOH či vanilinu. Výsledky jsou na vybraných místech výsledkové části a v závěru práce vhodně diskutovány. Bylo by hezké, kdyby se, do jisté míry, unikátní metabolismus Fa ve Schlegelelle podařilo zmapovat kompletně, ale to je téma spíše na dizertační práci. Autor nicméně potvrdil, že je žádoucí se biotransformací FA ve Schlegelelle dále zabývat. Tato bakterie se může vzhledem k velmi rychlé přeměně FA stát atraktivním hostitelem pro tento typ biotransformací. Drobné připomínky mám pouze ke grafickému provedení některých obrázků s metabolickými drahami, které mají rozmazané části a mohly být připraveny autorem v některém z volně dostupných grafických editorů a ne pouze přejaty z literatury. Další připomínky vypisuji už pouze v podobě bodů: - Kapitola 3.2.5 Stanovení supernatantu na HPLC. Na HPLC nestanovujeme supernatant ale v něm obsažené metabolity uvolněné buňkou. Doporučil bych tedy přesnější název kapitoly. - Autor uvádí na dvou místech práce dvě optimální teploty pro růst Schlegelelly (50 a 55°C). Doporučil bych sjednotit. - Kapitola k Taq DNA polymeráze v úvodu mi přišla trochu mimo hlavní „dějovou linku“ práce. - Zkratky v legendách grafů by měly být vysvětleny v popisku obrázku. - Autor opakovaně zmiňuje problém s nižší naměřenou koncentrací FA ve srovnání s teoreticky očekávanou koncentrací, a to hlavně u konc. FA 0.5 a 0.75 g/L. Domnívám se, že do určité míry mohl být tento problém způsoben i nízkou rozpustností FA ve vodě (0.78 g/L). Napovídal by tomu i fakt, že výtěžky VA či VanOH vypočítané z experimentálních koncentrací FA a derivátů byly často vyšší než 100%. Možná na úvod experimentu nebyla ještě FA zcela rozpuštěna a postupně se rozpouštěla až v dalších hodinách experimentu. - Str. 33, růst kmene LMG 21645 bych nenazval exponenciálním, jde spíše o lineární růst. - Obr. 22: graf tvorby biomasy v g/L kmene LMG 21645 nekoreluje s grafem nárůstu OD600 z téže kultivace. Autor to vysvětluje chybou v měření OD, ta ale musela být opakovaná… Nedocházelo například v první části kultivace ke vzniku agregátů buněk (stresová reakce na přítomnost toxické chemikálie), které by snižovaly měřené OD a postupně by třeba v druhé části kultivace docházelo k jejich rozpadu? S podobným chováním bakteriálních kultur se občas v přítomnosti toxických chemikálií či metabolitů setkáváme. - Důležitá poznámka: Chybové úsečky u datových bodů v grafech s naměřenými hodnotami OD600 a koncentracemi metabolitů jsou jak vertikální tak horizontální. Navíc se v rámci jednoho datového bodu často liší svou délkou. To je dost matoucí. Proč tomu tak je a co tyto úsečky ukazují? Jde o směrodatnou odchylku nebo standardní chybu měření? - Názvy mikroorganismů v seznamu literatury by mohly být kurzívou (citační programy to často neřeší, většinou upravujeme ručně). Navzdory těmto připomínkám práci jako celek hodnotím pozitivně, navrhuji ji k obhajobě a hodnotím známkou A.

Dílčí hodnocení
Kritérium	Známka	Body	Slovní hodnocení
Splnění požadavků zadání	A
Logické členění práce	A
Kvalita zpracování výsledků	B
Interpretace výsledků, jejich diskuse	A
Využití literatury a její citace	A
Úroveň jazykového zpracování	A
Formální úroveň práce – celkový dojem	B
Závěry práce a jejich formulace	A

Navrhovaná známka: A

Otázky

1) Atraktivním produktem biotransformace FA je kyselina vanilová (VA), vanilin, či vanilylalkohol (VanOH). Jak byste tyto látky z kultivačního média izoloval a přečistil?
2) Experimenty v této práci byly prováděny s čistou FA. Uvažujete o testech s lignocelulózovými hydrolyzáty. Popřípadě máte už k těmto komplexnějším substrátům nějaká data?
3) Je technologicky reálná ko-valorizace Fa a xylózy (tedy složek ligninu a hemicelulózy) na VA a PHA? Z Vašich experimentů je evidentní, že obě látky mají rozdílnou dynamiku produkce. Zdá se, že FA je Schlegelellou transformována bez nutnosti růstu v lag fázi (také možná produkce pomocí „resting cells“), zatímco PHA se tvoří v pozdějších časech kultivace, kdy buňky začínají růst.
4) Úvod, strana 25: Zmiňujete studii, ve které byla FA přeměňována na VA pomocí termofilní houby S. thermophile. Uvádíte, že za optimálních podmínek bylo dosaženo vysokých výtěžků VA. Jaké výtěžky (výtěžek g/g, titr g/L, či volumetrická produktivita g/L/h) mohou být z pohledu ekonomicky udržitelné bioprodukce VA, VanOH či vanilinu z FA z odpadní biomasy považovány za dostatečné? Existují studie, které by toto diskutovaly?
5) Z provedených experimentů se zdá, že optimální startovní koncentrace FA pro produkci VA pomocí Schlegelelly je někde kolem 0.3 – 0.5 g/L. Při využití jednoduchých batch kultivací by tak ale výtěžky VA či VanOH byly velmi nízké. Je podle Vás reálná biotechnologická produkce VA či VanOH z FA za využití fed-batch nebo kontinuální kultivace a nějaké formy on-line separace žádoucích, leč pro buňku více či méně toxických, produktů z média?