Produkce galaktozidázy kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu
Loading...
Date
Authors
ORCID
Advisor
Referee
Mark
A
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstract
Tato práce se zabývá studiem indukce - a -galaktosidáz kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu, korelací mezi produkcí těchto enzymů a růstem kvasinek, a jejich následnou biotypizací pomocí hmotnostní spektrometrie. V teoretické části jsou popsány všechny testované a příbuzné kvasinky, hydrolytické enzymy -galaktosidáza a -galaktosidáza, a také použité analytické metody UV-VIS spektrofotometrie a hmotnostní spektrometrie, především MALDI-TOF. Experimentální část obsahuje popis použitého přístrojového vybavení, přípravy potřebných roztoků, kultivace mikroorganismů na laktózovém médiu, měření enzymové aktivity spektrofotometricky a biotypizaci kvasinek hmotnostní spektrofotometrií. Každý z 18 testovaných kmenů kvasinek druhů Cr. carnescens (CCY 17-3-13), Cr. flavescens (CCY 17-3-6, CCY 17-3-15, CCY 17-3-29, CCY 17-3-31, CCY 17-3-33, CCY 17-3-38), Cr. flavus (CCY 17-3-5), Cr. laurentii (CCY 17-3-2, CCY 17-3-9, CCY 17-3-17, CCY 17-3-24), Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40), Cr. saitoi (CCY 17-3-18), Cr. victoriae (CCY 17-3-26) a Bulleromyces albus (CCY17-3-35, CCY 17-3-37) ze Sbírky kultur kvasinek, Chemický ústav SAV (CCY), byl kultivován po dobu 96 hodin v tekutém laktózovém médiu. V průběhu kultivace byl stanovován počet buněk v médiu a enzymová aktivita - a -galaktosidázy v médiu a na povrchu buněk. Laktózové médium nebylo vhodným kultivačním médiem pro všechny kvasinky rodu Cryptococcus, protože některé kmeny na něm rostly pomalu (CCY 17-3-29, CCY 17-3-5, CCY 17-3-26, CCY 17-3-35), nebo vykazovaly dlouhou adaptační fázi (CCY 17-3-2, CCY 17-3-6). Porovnání růstových křivek a grafů produkce aktivit povrchové -galaktosidázy v průběhu kultivace ukázalo, že mezi nimi není žádná blíže specifikovatelná závislost a výsledky tak nepotvrdily očekávaný vliv tohoto enzymu na růst kmene, ani předpokládaný nárůst produkce -galaktosidázy vlivem kultivace na laktóze. Nejrychlejší růst na laktóze vykazoval kmen Cr. carnescens CCY 17-3-13, který produkoval na svém povrchu velmi nízké aktivity tohoto enzymu. Relativně zvýšené množství tohoto enzymu bylo na povrchu kvasinek pozorováno jen v případě typového kmene Cr. laurentii CCY 17-3-2, kmene Cr. flavescens CCY 17-3-31 a Cr. flavus CCY 17-3-5. Stejně tak se značně lišila produkce -galaktosidázy kapsulárními kmeny, což vylučuje předpokládaný vliv tohoto enzymu na přestavbu a degradaci ochranné kryptokokální kapsuly. Výjimku tvořily pouze kmeny Cr. flavescens, které obecně můžeme považovat za producenty povrchové -galaktosidázy indukované laktózovým médiem. V ostatních případech byla produkce tohoto enzymu záležitostí jednotlivého kmene, ne všeobecně druhu, např. v případě typového kmene Cr. laurentii. Obdobná indukce byla ovšem pozorována i u jiných kvasinek a hub, a proto jakákoliv souvislost s kapsulí byla vyloučena. V souvislosti se zvoleným kultivačním médiem bylo druhým cílem práce otestovat vhodnost laktózového média pro biotypizaci kvasinek rodu Cryptococcus hmotnostní spektrometrií. Naměřená čárová hmotnostní spektra vykazují při vzájemném porovnání nízké podobnostní skóre, takže není možné spolehlivě určit, o jaký druh se jedná. Taktéž dělení zástupců rodu Cryptococcus podle fylogenetických linií nebylo programem Biotyper provedeno správně a i blízce si příbuzné kmeny byly zařazeny na odlišné vývojové větve. Výsledky testování tak řadí laktózu k nevhodným médiím pro biotypizaci mikroorganismů hmotnostní spektrometrií.
This work focuses on the induction of galactosidases by yeasts of genus Cryptococcus growing on lactose medium and relations between this production and growth of yeasts. At the end biotyping using mass spectrometry is described. All tested and relative yeasts, hydrolytic enzymes -, -galactosidase and used analytical methods as UV-VIS spectrophotometry and mass spectometry, especially MALDI-TOF are described in the theoretical part. The experimental part consists of description of instrumentations, preparation of necessary solutions, cultivation of microorganisms, measurement of enzymatic activity spectrophotometrically and biotyping of yeasts by mass spectrometry. Each of the 18 tested yeast strains, including species Cr. canescens (CCY 17-3-13), Cr. flavescens (CCY 17-3-6, CCY 17-3-15, CCY 17-3-29, CCY 17-3-31, CCY 17-3-33, CCY 17-3-38), Cr. flavus (CCY 17-3-5), Cr. laurentii (CCY 17-3-2, CCY 17-3-9, CCY 17-3-17, CCY 17-3-24), Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40), Cr. saitoi (CCY 17-3-18), Cr. victoriae (CCY 17-3-26) and Bulleromyces albus (CCY17-3-35, CCY 17-3-37) from the Culture Collection of Yeasts, Institute of Chemistry of SAS (CCY), was cultured for 96 hours in a liquid medium with lactose. During cultivation, the quantity of cells was determined as well as enzyme activities of - and -galactosidase in the medium and on the cell surface. Lactose medium was shown not to be suitable culture medium for all Cryptococcus strains, because some of them grew on it very slowly (CCY 17-3-29, CCY 17-3-5, CCY 17-3-26, CCY 17-3-35), or showed a long adaptation phase (CCY 17-3-2, CCY 17-3-6). A comparison of the growth and surface -galactosidase production curves showed that the link between lactose medium and production of this enzyme does not exist in generally. The results did not confirm neither the expected impact of this enzyme on the growth of strains nor the anticipated induction of -galactosidase by lactose. For instance, the fastest growth on lactose showed the strain Cr. canescens CCY 17-3-13, which exhibited a very low activity of this enzyme on its surface. Relatively increased production of this enzyme was observed on the surfaces of the type strain Cr. laurentii CCY 17-3-2, strain Cr. flavescens CCY 17-3-31 and Cr. flavus CCY 17-3-5. The production of -galactosidase by capsular yeasts was strain-dependent with the exception of the members of Cr. flavescens species. Because of this, the expected general influence of this enzyme on the re-building of the protective cryptococcal capsule can be excluded. Only Cr. flavescens strains can be generally considered as producers of lactose-inducible surface -galactosidase. In other cases, the production of this enzyme matters on single strain and not on species, as can be seen in the case of type strain Cr. laurentii and the other Cr. laurentii strains. Similar induction by lactose medium was also observed with non-cryptococcus yeasts and fungi and therefore the link with the capsules can be also excluded. In connection with the selected culture medium, the second aim of this work was to test the suitability of lactose medium for genus Cryptococcus biotyping by mass spectrometry. Normalized spectra showed very low score between strains of the same species and as a consequence, close related strains were included in the different evolutionary branches using Biotyper programme. These findings led to the conclusion that lactose medium is an unsuitable medium.
This work focuses on the induction of galactosidases by yeasts of genus Cryptococcus growing on lactose medium and relations between this production and growth of yeasts. At the end biotyping using mass spectrometry is described. All tested and relative yeasts, hydrolytic enzymes -, -galactosidase and used analytical methods as UV-VIS spectrophotometry and mass spectometry, especially MALDI-TOF are described in the theoretical part. The experimental part consists of description of instrumentations, preparation of necessary solutions, cultivation of microorganisms, measurement of enzymatic activity spectrophotometrically and biotyping of yeasts by mass spectrometry. Each of the 18 tested yeast strains, including species Cr. canescens (CCY 17-3-13), Cr. flavescens (CCY 17-3-6, CCY 17-3-15, CCY 17-3-29, CCY 17-3-31, CCY 17-3-33, CCY 17-3-38), Cr. flavus (CCY 17-3-5), Cr. laurentii (CCY 17-3-2, CCY 17-3-9, CCY 17-3-17, CCY 17-3-24), Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40), Cr. saitoi (CCY 17-3-18), Cr. victoriae (CCY 17-3-26) and Bulleromyces albus (CCY17-3-35, CCY 17-3-37) from the Culture Collection of Yeasts, Institute of Chemistry of SAS (CCY), was cultured for 96 hours in a liquid medium with lactose. During cultivation, the quantity of cells was determined as well as enzyme activities of - and -galactosidase in the medium and on the cell surface. Lactose medium was shown not to be suitable culture medium for all Cryptococcus strains, because some of them grew on it very slowly (CCY 17-3-29, CCY 17-3-5, CCY 17-3-26, CCY 17-3-35), or showed a long adaptation phase (CCY 17-3-2, CCY 17-3-6). A comparison of the growth and surface -galactosidase production curves showed that the link between lactose medium and production of this enzyme does not exist in generally. The results did not confirm neither the expected impact of this enzyme on the growth of strains nor the anticipated induction of -galactosidase by lactose. For instance, the fastest growth on lactose showed the strain Cr. canescens CCY 17-3-13, which exhibited a very low activity of this enzyme on its surface. Relatively increased production of this enzyme was observed on the surfaces of the type strain Cr. laurentii CCY 17-3-2, strain Cr. flavescens CCY 17-3-31 and Cr. flavus CCY 17-3-5. The production of -galactosidase by capsular yeasts was strain-dependent with the exception of the members of Cr. flavescens species. Because of this, the expected general influence of this enzyme on the re-building of the protective cryptococcal capsule can be excluded. Only Cr. flavescens strains can be generally considered as producers of lactose-inducible surface -galactosidase. In other cases, the production of this enzyme matters on single strain and not on species, as can be seen in the case of type strain Cr. laurentii and the other Cr. laurentii strains. Similar induction by lactose medium was also observed with non-cryptococcus yeasts and fungi and therefore the link with the capsules can be also excluded. In connection with the selected culture medium, the second aim of this work was to test the suitability of lactose medium for genus Cryptococcus biotyping by mass spectrometry. Normalized spectra showed very low score between strains of the same species and as a consequence, close related strains were included in the different evolutionary branches using Biotyper programme. These findings led to the conclusion that lactose medium is an unsuitable medium.
Description
Citation
PAVLATOVSKÁ, B. Produkce galaktozidázy kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2015.
Document type
Document version
Date of access to the full text
Language of document
cs
Study field
Biotechnologie
Comittee
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
prof. Ing. Peter Šimko, DrSc. (místopředseda)
doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. (člen)
doc. RNDr. Alena Španová, CSc. (člen)
doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. (člen)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
Date of acceptance
2015-06-17
Defence
1. Studentka seznámila členy komise s náplní a cílem bakalářské práce.
2. Byly přečteny posudky na bakalářskou práci.
3. Studentka akceptovala všechny připomínky oponenta a na všechny otázky odpověděla v plné šíři.
Diskuse
prof. Márová: Složení živného media ?
doc. Španová: Uspořádání experimentu ?
Result of defence
práce byla úspěšně obhájena
Document licence
Standardní licenční smlouva - přístup k plnému textu bez omezení