Sledování autenticity mleté skořice pomocí qPCR-HRM

Abstract

Tato diplomová práce se zabývá sledováním autenticity komerčních vzorků mleté skořice pomocí molekulárně-biologických a analytických metod. Cílem práce bylo provést determinaci botanických druhů skořicovníků obsažených v komerčních vzorcích mleté skořice metodou real-time PCR s vysokorozlišovací analýzou křivek tání (HRM) s využitím primerů TPS 1, TPS 3, ITS 2 a psbA-trnH. DNA byla izolována dvěma postupy: pomocí komerčního kitu EliGene a pomocí CTAB protokolu. Bylo zjištěno, že izolace DNA pomocí kitu poskytuje použitelné izoláty pouze v případě vzorků listů. Pro úspěšnou izolaci DNA z komerčních vzorků mleté skořice bylo nezbytné využít CTAB protokol. Následná amplifikace DNA u komerčních vzorků proběhla úspěšně s využitím primerů TPS 1, ITS 2 a psbA-trnH. Nejspolehlivější výsledky poskytly primery TPS 1. Naopak primery TPS 3 nebyly pro tuto analýzu vyhodnoceny jako vhodné. Za účelem ověření a srovnání výsledků získaných pomocí PCR byl u testovaných vzorků mleté skořice stanoven obsah kumarinu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Na základě zjištěného obsahu kumarinu byly vzorky klasifikovány dle dominantního zastoupení cejlonské skořice či cassií. Práce poukazuje na vhodnost kombinace real-time PCR s HRM a analytického stanovení obsahu kumarinu (HPLC) pro kontrolu autenticity, kvality a zdravotní bezpečnosti komerčně dostupné mleté skořice.This diploma thesis focuses on monitoring the authenticity of commercial ground cinnamon samples using molecular-biological and analytical methods. The aim of the study was to identify the botanical species of cinnamon present in commercial ground cinnamon samples using real-time PCR combined with high-resolution melting (HRM) curve analysis, utilizing TPS 1, TPS 3, ITS 2, and psbA-trnH primers. DNA was extracted using two different procedures: a commercial EliGene kit and the CTAB protocol. It was found that DNA extraction using the commercial kit yielded viable isolates only for leaf samples. To successfully extract DNA from the commercial ground cinnamon samples, the application of the CTAB protocol was essential. Subsequent DNA amplification of the commercial samples was successfully performed using the TPS 1, ITS 2, and psbA-trnH primers. The TPS 1 primers provided the most reliable results, whereas the TPS 3 primers were evaluated as unsuitable for this specific analysis. To verify and compare the results obtained via PCR, the coumarin content in the tested ground cinnamon samples was determined using high-performance liquid chromatography (HPLC). Based on the detected coumarin levels, the samples were classified according to the probable proportions of Ceylon cinnamon and Cassia. The thesis highlights the effectiveness of combining real-time PCR with HRM and the analytical determination of coumarin content (HPLC) to verify the authenticity, quality, and health safety of commercially available ground cinnamon.