Optimalizace produkce vybraných enzymů pomocí Bacillus subtilis - Slavíčková, Radka (Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická, 2012)
V diplomové práci byla studována optimalizace produkce lipolytických enzymů při submerzním způsobu kultivace Bacillus subtilis (BS). Produkce lipolytických enzymů byla testovaná v prostředí tří živných médií, která se lišila zejména hlavními zdroji uhlíku, resp. dusíku. První médium obsahovalo zejména extrakt z telecího mozku a hovězího srdce (BHIB), druhé médium pepton a kvasniční extrakt (NB) a třetí živné médium pepton a kvasniční extrakt s přídavkem 2% (w/v) glukózy (NBG). Nejvyšší lipolytické aktivity (0,0784 Uml-1) bylo dosaženo v médiu NBG, přičemž ve všech médiích bylo pozorováno maximum před koncem exponenciální fáze růstu. V NBG médiu bylo následně stanoveno teplotní optimum v rozmezí 30 - 50 °C, pH optimum v rozmezí 5 - 11 a tepelná stabilita lipolytických enzymů produkovaných BS. Aktivita byla stanovena spektrometricky za použití p-nitrofenyllaurátu jako substrátu. Produkované lipolytické enzymy vykazovaly nejvyšší aktivitu při teplotě 37 °C a v alkalické oblasti pH = 8,0. Měření tepelné stability ukázalo, že se jedná o poměrně termostabilní enzymy, které si i po 1 hodině kultivace při 30 - 50 °C zachovaly 100 % aktivity. Přítomnost 1% (w/v) olivového oleje v médiu NBG způsobovala po 14 dnech kultivace pokles lipolytické aktivity o 65 % a pokles hodnoty pH z 6,5 na 5,4. Po nahrazení glukózy fruktózou v živném médiu NBG vykazovala lipolytická aktivita během prvních 7 dní kultivace srovnatelné hodnoty, avšak po 14 dnech kultivace byl zaznamenán již pokles lipolytické aktivity o 29 %. Metodika identifikace lipolytických enzymů BS pomocí peptidového mapování byla vyvinuta za účelem porozumnění potenciálu syntetického polyesteru- poly(e-kaprolaktonu) působit jako induktor tvorby lipáz. Degradační studie komerčního polyesteru poly(e-kaprolaktonu) byla vedena při submerzním způsobu kultivace Bacillus subtilis v médiu NBG při počáteční hodnotě pH 7,0 a teplotě 30 °C po dobu 14 dnů. PCL (Mn=10 000, Mw=14 000) byl studován ve formě filmů (1,0 x 1,0 cm), které byly připraveny lisováním, ochlazováním taveniny na 4 °C a odpařováním dichlormetanu z 2% roztoku. U degradovaných filmů v závislosti na způsobu jejich přípravy byl pozorován po 14 dnech úbytek hmotnosti (7,8 - 17,0 hm. %.) a vznik četných děr a prasklin na povrchu vzorků. V degradačním médiu byly naměřeny hodnoty lipolytické aktivity vyšší o 9 - 17 % ve srovnání s kontrolními vzorky. Denzitometrické sledování nárůstu buněčné hmoty ukázalo rovněž vyšší hodnoty zákalů v degradačním médiu v porovnání s kontrolními vzorky. Na základě naměřených výsledků lze navrhnout, že studované vzorky byly degradovány v důsledku působení BS.

In this thesis, optimization of production of lipolytic enzymes by submerzed cultivation of Bacillus subtilis (BS) was studied. Production of lipolytic enzymes was tested in three nutrient media, which differed mainly in main sources of carbon, respectively of nitrogen. The first medium contained mainly extract from calf brain and beef heart (BHIB), the second medium contained peptone and yeast extract (NB) and the third one contained peptone and yeast extract with the addition of 2% (w/v) glucose (NBG). The highest lipolytic activity (0.0784 Uml-1) was measured in NBG medium. Maximum of lipolytic activity was observed before the end of the exponential phase of BS growth in all the media. Temperature optimum in NBG medium was determined from 30 to 50 °C, pH optimum in the range of 5 to 11 and subsequently the temperature stability of lipolytic enzymes produced by the BS was estimated. The activity value was determined spectrometrically using p-nitrophenyllaurate as a substrate. Produced lipolytic enzymes showed maximum activity at 37 °C in the alkaline pH of 8.0. Measurement of temperature stability showed that lipolytic enzymes are relatively thermostable enzymes retaining 100 % of the activity even after 1 hour of cultivation at 30 - 50 °C. The presence of 1% (w/v) olive oil in medium NBG caused a decrease in lipolytic activity by 65 % as well as in pH from 6.5 to 5.4 after 14 days of cultivation. After substitution of glucose by fructose in medium NBG, lipolytic activity showed comparable values during the first week of cultivation. On the other hand, the decrease of lipolytic activity by 29 % in the medium with fructose was observed after 14 days of cultivation. A procedure for the identification of lipolytic enzymes of BS by peptide massfingerprinting was developed to understand the potential of synthetic polyester - poly(e-caprolactone) as a lipase inductor. Degradation study of commercial polyester poly(e-caprolactone) was carried out by submerged cultivation of Bacillus subtilis in NBG medium at initial pH 7.0 and 30 °C for 14 days. PCL (Mn = 10,000, Mw = 14 000) was studied in the form of films (1.0 x 1.0 cm), which were prepared by melt-pressing, rapid cooling of the melt to 4 °C and evaporation of the solvent from 2 % dichlormethane solution. The evaluation of the films shown occurrence of weight loss (7.8 - 17.0 wt.%) together with the formation of numerous holes and cracks in the sample surface in relation to the method of the films preparation. Lipolytic activity values increased by 9 - 17 % in the degradation media compared to control samples. Densitometric monitoring showed also higher increase in cell mass in the degradation medium compared with control samples. Based on the results obtained, the degradation process induced by BS could be suggested.
Optimization of the Production of Lipases by Bacillus subtilis
Keywords: Bacillus subtilis; lipolytické enzymy; lipolytická aktivita; optimalizace; živné médium; pH optimum; teplotní optimum; tepelná stabilita; degradace; poly(e-kaprolakton); Bacillus subtilis; lipolytic enzymes; lipolytic activity; optimization; growth medium; pH optimum; temperature optimum; temperature stability; degradation; poly(e-caprolactone)