Řízená evoluce enzymů na mikrofluidním čipu - Kohúteková, Táňa (Vysoké učení technické v Brně. Fakulta elektrotechniky a komunikačních technologií, 2023)
Tato práce se zaměřuje na řízenou evoluci enzymů pomocí fluorescenčně řízeného kapénkového třídení (ang. zkratka FADS) na mikrofluidním čipu. Byl sestaven nový třídicí systém, který byl validován pro vysoce výkonnou optickou detekci mikrofluidních kapének spojenou s dielektrickým tříděním. Systém byl testován pomocí dvou různých (DhaA31, ancHLD-RLuc) populací haloalkan dehalogenas (HLD) exprimovaných v buňkách Escherichia coli a jedné populace prázdného vektoru pIDR9 v poměru 5:45:50, což imituje proteinovou knihovnu. Naměřená a analyzovaná data z experimentu ukazují, že intenzity kapek ve validačním experimentu byly zaznamenány v stejném poměru jako teoretický poměr. Poté byla knihovna HLD mutantů s inzercemi a delecemi tříděna pomocí FADS, za účelem získaní 1 % nejaktivnějších variant. Program pro analýzu dat pro FADS byl programován v prostředí LabVIEW s využítím jazyka Python, s funkcemi pro počáteční analýzu, predikci prahového napětí, validaci a grafickou interpretaci dat a konečnou zprávu o experimentu.

This thesis focuses on the directed evolution of enzymes using Fluorescence–Activated Droplet Sorting (FADS) on a microfluidic chip. A new FADS system was constructed, validated for high-throughput optical detection of microfluidic droplets, and coupled with real-time dielectrophoretic sorting. The system was benchmarked using two different populations (DhaA31, ancHLD-RLuc) of Haloalkane dehalogenases (HLD) expressed in Escherichia coli cells and one population of empty pIDR9 vector in a ratio of 5:45:50, mimicking the protein library. The collected and analyzed sorting data show that the droplet intensities were recorded in the same proportion as the theoretical ratio. The library of HLD mutants with insertions and deletions was then sorted using the system to obtain 1 % of the variants with the highest activity and the results are reported. The FADS data analyzing system was programmed in LabVIEW bundled with Python, with functions for initial analysis, prediction of threshold voltage, validation and graphical interpretation of data, and final reporting of processes.
Directed evolution of enzymes on microfluidic chip
Keywords: Třízení knihoven na čipu; řízená evoluce; dehalogenasy; mikrofluidika; Library sorting; directed evolution; lab-on-chip; dehalogenase; FADS; microfluidics