Strukturální studie extracelulárních domén adheze G protein-spojeného receptoru ADGRG4 - Strnadová, Martina (Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická, 2023)
Bunková komunikácia je schopnosť buniek príjmať, vysielať a spracovávať signály zo svojho okolia. Môžeme teda hovoriť o komunikácii medzi bunkami a orgamizmom. Extracelulárne stimuly spúšťajú signál, ktorý interaguje s receptormi na bunkovom povrchu, čo má za následok aktiváciu intracelulárnych signálnych proteínov. Tieto proteíny sú rozdelené do viacerých rodín podľa ich špecifickej sekvencie, domén ktoré obsahujú, alebo ligandov, s ktorými interagujú. Jednou z týchto rodín je práve receptorová rodina adhezívnych receptorov spojených s G proteínom (aGPCR), ktorá obsahuje 33 členov. Najnovšie štúdie naznačujú, že fungujú z veľkej časti ako mechanoreceptory; avšak, pre niektorých členov boli identifikované aj ligandy pre ich aktiváciu. V porovnaní s inými GPCR sa táto rodina vyznačuje relatívne dlhou extracelulárnou oblasťou (ECR), ktorá obsahuje súbor rozličných štruktúrnych domén a motívov. ADGRG4 (GPR112) predstavuje jeden z najväčších aGPCR s dĺžkou reťazca väčšou ako 3000 aminokyselín (aa). Väčšina jeho reťazca aa sa nachádza v extracelulárnom priestore (viac ako 2500 aa). Je známe, že ADGRG4 je špecificky exprimovaný v enterochromafinných bunkách umiestnených v epiteli ľudského tenkého čreva. Tieto enteroendokrinné bunky sú zodpovedné za produkciu a sekréciu serotonínu a reagujú na chemické a mechanické podnety. K dnešnému dňu však fyziologická funkcia ADGRG4 v týchto bunkách zostáva neznáma. Cieľ tejto práce bol rozdelený na dve časti. V prvej časti bola snaha o poskytnutie štruktúrnych informácií o obrovskej extracelulárnej oblasti ADGRG4. ECR bola rozdelená na viacero častí pre lepšie skúmanie. Následne boli vzorky exprimované v ľudských embryonálnych obličkových bunkách 293 (HEK293S bunky). Výsledné proteínové štruktúry boli purifikované viacerými technikami. Pre zvýšenie možnosti kryštalizácie, bol purifikovaný proteín deglykozylovaný a až potom podrobený na kryštalizačné pokusy. Druhá časť sa zaoberala analýzou NTF-konštruktov, dobre preskúmaných ADGRs. Tieto konštrukty neobsahovali C-terminálny koniec (CTF), iba N-terminálnu časť (NTF). Desať rôznych proteínov bolo úspešne naklonovaných a expresovaných v HEK293T bunkách. Na vyhodnotenie výsledkov oligomerného stavu vzoriek z prvej aj druhej časti boli použité techniky Native PAGE a dynamický rozptyl svetla (DLS). Ako kontrola autoproteolýzy, ktorá je typickým znakom aGPCR, sa využili rozličné techniky Western blotting (WB). Metóda nano-diferenciačná skenovacia fluorescencia (DSF) sa využila na stanovenie pripravených konštruktov a na nájdenie optimálnych podmienok pre roztoky, ktoré sa v práci používali. Výsledky z prvej časti ukazujú za akých podmienok dokážeme nami vytvorený konštruk podrobiť kryštalizácii a následne ďalej pokračovať v jeho výskume. Druhá časť nám ukázala, ktoré nami klonované konštrukty sa dokážu stabilne expresovať v HEK293T bunkách. Na základe získaných parametrov z prvej a druhej časti dokáže výskum v tejto oblasti rozšíriť a do buducnosti získať dôležité informácie ohľadom týchto pozoruhodných receptorov.

The aim of this thesis was to provide structural information on the huge extracellular region (ECR) of ADGRG4 that allows hypothesis of the function of the receptor. Therefore, the ECR was dissected into smaller, likely independently folded subunits. Subsequently, these samples were recombinantly expressed in human embryonic kidney 293 cells (HEK293S cells). These protein constructs were purified to allow for subsequent biophysical characterization. To increase the possibility of protein crystallisation, the purified protein was deglycosylated and then subjected to crystallisation trials. The second part of this thesis dealt with the analysis of the construct that contained the NTF part (the CTF was lacking), of well-established ADGRs. Ten different constructs were successfully cloned and expressed in HEK293T cells. Native PAGE and Dynamic Light Scattering (DLS) techniques were used to evaluate the results of the oligomeric state of the samples from both parts. As a control for autoproteolysis, which is a typical feature of aGPCR, various WB techniques were used. The Nano-Differential Scanner Fluorescence (DSF method was used to determine the prepared constructs and to find the optimal conditions for the buffers used in the thesis. The results of the first part show under which conditions the crystallisation trials were the most suitable that can be repeated and optimized further in the research. The second part showed which cloned constructs were able to be expressed in cells. Based on the parameters obtained from the first and second parts, research in this area can continue and, in the future, we can obtain important information about these remarkable receptors.
Structural Studies on Extracellular Domains of adhesion G Protein-Coupled Receptor ADGRG4
Keywords: aGPCR; ADGRG4; NTF-konštrukty; molekulárne klonovanie; dynamický rozptyl svetla; nano.diferenciačná skenovacia fluorescencia; proteínová kryštalizácia; aGPCR; ADGRG4; NTF-constructs; molecular cloning; Dynamic Light Scattering; Nano-Differential Scanner Fluorimetry; protein crystallisation