Metabolická a biofyzikální charakterizace bakteriálních buněk schopných akumulace PHA - Slaninová, Eva (Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická, 2021)
Předložená disertační práce se zabývá charakterizací bakteriálních buněk schopných akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA). Disertační práce je vypracovaná formou komentované diskuse publikovaných prací, které jsou součástí příloh. Práce rozvíjí aktuální téma studia protektivních funkcí PHA a nově objasňuje některé protektivní mechanismy vůči vybraným stresorům. V rámci práce byly studovány protektivní účinky PHA granulí před UV zářením a osmotickým stresem, konkrétně hypotonickým prostředím. V případě expozice buněk UV zářením jsou buňky chráněny především díky rozptylu UV záření na granulích, které se vyskytují v těsné blízkosti nukleoidu. U osmotického stresu hraje klíčovou roli amorfní stav PHA granulí, který stabilizuje buněčné membrány při hypertonickém namáhání buněk, načež jsou bakteriální buňky lépe schopné odolávat přechodu do hypotonického prostředí a udržet si svoji buněčnou integritu. Obecně je možné konstatovat, že amorfní stav PHA granulí je klíčový pro zajištění správné biologické funkce PHA, ať už jako zásobního nebo protektivního polymeru. Proto jsme se v další části této práce věnovali objasnění podstaty stabilizačního mechanismu, který chrání nativní PHA granule před krystalizací a udržují tak intracelulární polymer v termodynamicky nevýhodném fázovém stavu. Na základě experimentálních poznatků, kde jsme aplikovali vybrané stresy, jsme navrhli nový model stabilizace amorfního stavu PHA granulí in vivo. Jedná se o kombinaci dvou mechanismů, kdy je z důvodu malého objemu granulí snížena rychlost krystalizace a zároveň voda přítomná v granulích plní roli nízkomolekulárního plastifikátoru. Díky metabolickému aparátu buněk jsou PHA neustále syntetizovány a zároveň degradovány, což vede k navýšení intracelulární koncentrace monomerů, které rovněž figurují v protektivním efektu PHA. V tomto kontextu jsme se tedy zaměřili na popis mechanismu kryoprotektivního účinku 3-hydroxybutyráru, monomeru nejrozšířenějšího zástupce PHA, poly(3-hydroxybutyrátu). Byl sestrojen rovnovážný a nerovnovážný fázový diagram systému 3HB-voda, díky kterému je možné konstatovat, že 3HB představuje velice efektivní kryoprotektant, což má fundamentální význam pro pochopení protektivních vlastností PHA, ale tato skutečnost může být také aplikačně využita například při úchově biologických vzorků anebo v potravinářském průmyslu.

This thesis deals with the characterization of bacterial cells capable of polyhydroxyalkanoates (PHA) accumulation. The dissertation thesis is written in the form of a discussed published publications which are attached to the thesis as appendixes. The work develops a study of the current topic of the protective functions of PHA and clarifies protective mechanisms against selected stressors. Firstly, we focused on the protective effects of PHA granules against UV radiation and osmotic stress, specifically hypotonic conditions. In the case of UV exposition, the cells protected themselves by scattering UV radiation on the intracellular granules protecting especially nucleoid. When exposed to osmotic stress, the amorphous state of PHA granules is very important since it is capable of stabilization of cell membranes under hypertonic stress, afterwards, bacterial cells can maintain their integrity during the subsequent hypotonic challenge. In general, the amorphous state of PHA granules is key to ensure the proper biological functions of PHA whether as storage or protective polymer. Therefore, in the next part of this work, we focused on the core of the stabilization mechanism that protects native PHA granules from crystallization and thus the intracellular polymer maintains in a thermodynamically unfavorable amorphous phase state. Based on experimental work, we applied selected stresses because we proposed a new model of stabilization of the amorphous state of PHA granules in vivo. It consists of two mechanisms, where small volumes of PHA granules reduce the rates of crystallization and at the same time the water present in the granules plays the role of a low molecular plasticizer. Due to the metabolic apparatus of bacterial cells, PHA are simultaneously synthesized and degraded which leads to an increment of intracellular concentration of monomers that also figure in the protective effect of PHA. In this context, we aimed at the description of the mechanism of cryoprotective effects of 3-hydroxybutyrate, the monomer of the most common of PHA, poly(3-hydroxybutyrate). Hence, we constructed an equilibrium and non-equilibrium phase diagram of the 3HB-water system to prove that 3HB is a very effective cryoprotectant. This fundamental understanding of the protective properties of PHA monomers could be also used in the food industry or cryopreservation of biological samples.
Metabolic and biophysical characterization of bacterial cells capable of PHA accumulation
Keywords: Polyhydroxyalkanoáty; Cupriavidus necator H16; stresová odpověď bakterií; UV záření; osmotický stres; amorfní stav; kryoprotektivní účinek; fázový diagram.; Polyhydroxyalkanoates; Cupriavidus necator H16; bacterial stress response; UV radiation; osmotic stress; amorphous state; cryoprotective effect; phase diagram