Stanovení viability u rhizobakteriálních kultur - Svobodová, Lucie (Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická, 2024)
Tato závěrečná práce je zaměřena na studium viability rhizobakterií podporující růst rostlin (PGPR). Viabilita byla stanovována u tří kmenů bakterie Azotobacter vinelandii, a to CCM 289, DSM 87 a DSM 720 pomocí průtokové cytometrie s fluorescenční sondou PI, SYTOXTM Blue a DAPI, a to po 120 a 72 hodinách kultivace. Byla provedena optimalizace vhodné fluorescenční sondy pro daný kmen, kdy jako nejvhodnější se jevilo použití sondy PI pro kmen CCM 289. Pro kmeny DSM 87 a DSM 720 lze použít sondy PI a SYTOXTM Blue. Pro následující experimenty byl vybrán kmen DSM 87, který byl podroben vlivu různých síťovacích činidel. Pomocí průtokového cytometru a barvení fluorescenční sondou PI byla ověřována viabilita po aplikaci roztoků chloridu vápenatého, barnatého, měďnatého, železitého, hlinitého a síranu vápenatého o koncentraci 2, dále 0,2 a 0,02 hm. % ke kultuře. Roztoky chloridu vápenatého, barnatého a síranu vápenatého neměly významný vliv na viabilitu buněk. Naopak při použití chloridu železitého byl zjištěn trend, kdy s klesající koncentrací roztoků ubývalo odumřelých buněk. Tohoto jevu bylo docíleno i při použití chloridu hlinitého a měďnatého, u kterých však použití nejkoncentrovanějšího roztoku mělo za následek inaktivaci většího počtu buněk než v předchozím případě, u chloridu hlinitého došlo ke ztrátě viability většiny přítomných buněk. Viabilita byla ověřována také u buněk uvolňovaných z připravených gelů. Pro experimenty byly zvoleny roztoky výše zmíněných síťovacích činidel o koncentraci 2 hm. %, za experimentálně stanovených podmínek byla kultura podrobena gelaci. Část gelů byla následně ponechána ve fosfátovém pufru, aby došlo ke zpětnému uvolnění buněk. Pro toto snazší uvolňování byl přidán enzym algináza, jehož účinkem je rozkládání alginátu. Bylo zjištěno, že koncentrace 2 hm. % vybraných síťovacích činidel neměla vliv na viabilitu buněk, tedy že buňky uvolněné z gelu se se jevily jako viabilní.

This thesis focuses on the study of viability of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR). Viability was determined in three strains of Azotobacter vinelandii, namely CCM 289, DSM 87 and DSM 720, using flow cytometry with fluorescent probe PI, SYTOXTM Blue and DAPI after 120 and 72 hours of cultivation. Optimization of the appropriate fluorescent probe for the strain was performed, with the PI probe for strain CCM 289 being the most suitable. PI and SYTOXTM Blue probes can be used for strains DSM 87 and DSM 720. For the following experiments, strain DSM 87 was selected and subjected to the influence of different crosslinking reagents. Using a flow cytometer and staining with a fluorescent PI probe, the viability was verified after application of calcium chloride, barium, copper, ferric, aluminium and calcium sulphate solutions of 2, 0.2 and 0.02 wt. % to the culture. Calcium chloride, barium and calcium sulfate solutions had no significant effect on cell viability. On the other hand, when ferric chloride was used, a trend was observed where dead cells decreased with decreasing concentration of the solutions. This effect was also achieved with aluminium and copper chloride, but the use of the most concentrated solution resulted in the inactivation of a greater number of cells than in the previous case, whereas aluminium chloride resulted in the loss of viability of most of the cells present. Viability was also verified for cells released from the prepared gels. For the experiments, solutions of the aforementioned crosslinking agents were chosen at a concentration of 2 wt.%, and the culture was subjected to gelation under the experimentally determined conditions. A portion of the gels was subsequently left in phosphate buffer to allow for the re-release of cells. To facilitate this release, the enzyme alginase was added to break down the alginate. It was found that a concentration of 2 wt % of the selected crosslinking agents did not affect cell viability, i.e., the cells released from the gel appeared to be viable.
Determination of vibality of rhizobacterial cultures
Keywords: Alginát; Azotobacter vinelandii; fluorescenční sondy; PGPR; průtoková cytometrie; rhizobakterie; viabilita; Alginate; Azotobacter vinelandii; flow cytometry; fluorescent probes; PGPR; rhizobacteria; viability