KRÁLOVÁ, R. Stanovení léčiv v pitných vodách metodou HPLC [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2015.

Posudek vedoucího

Vávrová, Milada

Jmenovaná studentka kombinované formy studia měla problém se dostat na vhodnou přístrojovou techniku, která by ji umožnila získat dostatečný počet lépe reprodukovatelných výsledků; měření prováděla na VUT až po semestru a to v době hospitalizace školitelky. Přesto se snažila získané výsledky interpretovat a vyvodit z nich závěry. Hodnotím zejména její snahu dokončit diplomovou práci v termínu.

Posudek oponenta

Čáslavský, Josef

Diplomová práce má název „Stanovení léčiv v pitných vodách metodou HPLC“ Nicméně jejím obsahem je stanovení dvou sloučeniny ze skupiny makrolidových antibiotik v pitné vodě pomocí HPLC/MS. Práce v rozsahu 73 stran je strukturována standardním způsobem (Úvod, Teoretická část, Experimentální část, Výsledky a diskuse, Závěr). Seznam citované literatury má 81 položek, z tohoto počtu je 35 odkazů na knihy, 32 na aktuální časopisecké publikace, 10 na internetové stránky. V textu lze nalézt poměrně dost chyb a nesrovnalostí – skoro se zdá, že chyběla poslední pečlivá revize textu před tiskem. Jako doklad lze uvést např. větu ze str. 23, konstatující, že „Využití všech těchto technik vyžaduje vhodný tep detektorů, které zaručí optimální kvalitativní a kvantitativní stanovení sledovaných látek“ - je zde překlep, vyšinutí z větné vazby a nesprávná elementární analytická terminologie. Poměrně častým prohřeškem je špatné kladení čárek, překvapil mne způsob užívání číslovek - například tvar „15-ti skupin“ (str. 9) není zrovna v souladu s pravidly mateřštiny, a což teprve tvary typu „17-ti členným kruhem“, hojně se vyskytující na str. 20 i jinde. Dále bych podotkl, že pojem „plazma“ (rod ženský – str. 20 nahoře) se používá pro krevní plazmu, na zmíněném místě mělo být „plazmatu“. Namísto „molekulová hmotnost“ bych doporučil pojem „molární hmotnost“. Formulaci „více odolnější“ (str. 23) bych označil jako komparativ na druhou. Se stupňováním má autorka problém i na následující straně, kde používá obratu „více spolehlivé“ (= spolehlivější). K jednotlivým částem diplomové práce mám následující věcné připomínky: Teoretická část: 1. Str. 24 – nesouhlasím s popisem vzorkování zde prezentovaným. Ruční odběry jsou používány jak pro těkavé, tak pro polotěkavé a netěkavé analyty. Charakteristika směsného vzorku je nesprávná, pojem „kompozitní vzorek“ není správně použit. 2. Kap. 2.3.2.2 SPE – překvapilo mne tvrzení o volbě velikosti pórů tuhého sorbentu podle velikosti separovaných molekul. Tvrzení o termální desorpcí sorbovaných sloučenin u SPE je poněkud nemístné vzhledem k charakteru sloučenin, které se touto technikou z vod izolují. Jak chce autorka prosávat vzorek sorpční kolonkou pomocí vodní vývěvy pod tlakem? Využití odstředivky k aplikaci vzorku na SPE kolonky se v analýze vody nepoužívá. Složky mají být koextrahované, nikoliv koextrahující. Obrázek č. 10 nezobrazuje instrumentaci SPE, jak hlásá titulek, ale postup SPE. Termín „silný aniontově výměnný typ sorbentu“ (viz str. 26) je hodně kostrbatý, říká se většinou „silný anex“. Zajímalo by mne, jak si autorka představuje promytí SPME mobilní fází u LC za účelem desorpce zachycených látek. Popis použití SPE s membránovými disky je poněkud nepřesný – disky nejsou membránové, a co je „vysoká hustota sorbentu“? 3. Kap. 2.3.3.1: Proces separace je popisován opět poněkud nepřesně až nesprávně. Rozdělovací chromatografie je založena nikoliv na separaci analyzované složky mezi dvě nemísitelné kapalné fáze, ale na separaci složek vzorku na základě jejich rozdílné distribuce mezi dvěma nemísitelnými fázemi. Nad popisem adsorpční chromatografie zůstává rozum stát; co chtěla autorka sdělit formulací „Adsorpční chromatografie využívá procesu adsorpce v závislosti na jeho schopnosti sorpce na povrchu tuhé fáze“? Termín „iontově výměnná chromatografie“ je zastaralý, dnes se používá označení „iontová chromatografie“. 4. Kap. 2.3.3.2 popisující zařízení a části kapalinového chromatografu je obsahuje řadu nepřesností a chybných tvrzení. Kapalinový chromatograf nemá regulátor průtoku, průtok určuje čerpadlo. Zásobníky mobilní fáze nejsou doplněny odplyňovačem, toto je samostatná součást kapalinového chromatografu. Mobilní fáze nemohou být vedeny pomocí vysokotlakého čerpadla do směšovače; v chromatografické systému je mobilní fáze jediná, ale může mít více složek, jejichž zastoupení se může v průběhu analýzy měnit, což je gradientová eluce. Membránová čerpadla se v HPLC vůbec nepoužívají, tvrzení o zařazení dvou čerpadel za sebe pro kvalitní analýzu je nesmysl jak formulačně, tak věcně; jedná se o jedno dvoupístové čerpadlo. Formulace „aby fáze sání a fáze výtlaku byla v rovnováze a navazovala na sebe“ je pochybná – sání a výtlak u pístového čerpadla na sebe navazují a nelze vytlačit jiný objem, než byl nasát. Tvrzení o dávkování v HPLC pomocí injekční stříkačky, kdy dochází k protržení pryžového septa, je hrozný nesmysl. Tak by mohl nastřikovat pouze Chuck Noris, běžný operátor nemá šanci do HPLC kolony pod průtokem mobilní fáze vzorek natlačit. Pojem „kohout“ je relevantní ve spojení s kurníkem; autorka by měla použít termín „dávkovací ventil“. Existence automatického dávkovače s částečně plněnou smyčkou umožňující variabilitu dávkovaného objemu autorce unikla (přestože ho využívala v rámci experimentální části). Silikagel opravdu nebývá modifikovaný např. grafitem či kopolymerem styrenu; pojem „kopolymer styrenu“ je sám o sobě taky špatně. V kolonách typu HyPurity se sotva nevyskytuje oktadecylový radikál. 5. Kap. 2.3.4. Detekční techniky: Autorka neprávně používá pojem „citlivost“ namísto „meze detekce“. Překvapuje mne tvrzení, že pro makrolidová antibiotika je oblíbeným detektorem UV-VIS detektor – jsou v jejich struktuře chromofory? 6. Kap. 2.3.4.1 Spektrofotometrické detektory: Výčet vlnových délek, při nichž „základní typy UV-VIS detektorů“ pracují, je archaismus. Termín „detektor diodového pole“ je nesprávný, má být „detektor s diodovým polem“. Častěji než deuteriová výbojka se jako zdroj záření dnes využívá vysokotlaká xenonová výbojka. Pojem „trojrozměrný záznam spektra“ překvapuje, UV-VIS spektrum je dvojrozměrné. 7. Kap. 2.3.4.3 Fluorescenční detekce: U fluorescence při absorpci fotonu nedochází k přechodu molekuly ze singletového do excitovaného vibračního stavu ani k dopadu molekuly zpět do základního stavu. Excitační mřížka nevybírá excitační záření, jale pouze rozkládá světlo podle vlnových délek, k výběru monochromatického záření je nezbytná štěrbina. Obdobně u emisního monochromátoru. 8. Kap. 2.3.4.4. Hmotnostní spektrometr – na základě čeho konstatuje autorka, že „zájem o analýzy pomocí LC-MS nestále stoupá“? Krom toho už LC-MS je tandemový systém, nejen LC-MS-MS. K vyjmenovaným ionizačním technikám: Termoprej se dnes už nevyužívá, zato se používá chemická ionizace za atmosférického tlaku a fotoionizace za atmosférického tlaku, o nichž se autorka nezmiňuje. Desorbuje se plazmatem, nikoliv plazmou. Tyče kvadrupólu nejsou kruhového nebo hyperbolického tvaru, ale průřezu. V kvadrupólu nezůstávají žádné ionty – ty jím prolétávají. Tvzení, že iontová past je složitějším typem kvadrupólu, by platilo pro lineární iontovou past, ale autorka v dalším textu popisuje iontovou past sférickou! A ta se od kvadrupólu dost výrazně liší. Pojem „vysokofrekvenční napětí se střídavou amplitudou“ je podivný. Není pravdou, že krycí (podle autorky krajní) elektrody sférické iontové pasti jsou uzemněny. Tvrzení, že ionty vstoupivší do pasti začnou se pohybovat po kružnici, je nesmysl, stejně tak jako následující konstatování, že se zvyšující se amplitudou se změní směr jejich pohybu. Vysvětlení funkce průletového analyzátoru je nesprávné. 9. Kap. 2.3.5 Porovnání HPLC a UHPLC vyvolává pochyby o orientaci autorky v teoretických základech separačních technik. Co je „zvýšení separace“? Tvrzení, že pro UHPLC je zapotřebí tlak okolo 100 MPa, je nepřesné. Tvrzení o nutnosti použití velkého čerpadla je nesmysl. Tvrzení o nutnosti použití dávkovacího zařízení s rychlými nástřiky je irelevantní – v kapalinové chromatografii se dávkuje zařazením dávkovací smyčky se vzorkem do toku mobilní fáze. Termín „výplň“ je nesprávný, v kolonách je náplň. Odkaz na parametr C ve van Deemterově rovnici bez uvedení této rovnice postrádá smysl. Experimentální část: 1. Kap. 3.3. Přístroje a zařízení: Čistota dusíku je nesprávně uvedena - má být 4.7; firma Linde Technoplyn, uvedená jako dodavatel tohoto dusíku, neexistuje od roku 2006. Krom toho – pokud se odpařovalo na ÚCHTOŽP, tak dusík byl od firmy SIAD. 2. Kolony Kinetex nedodává firma Agilent USA. 3. SPE kolonky Oasis HLB jsou popsány nesprávně. 4. Zařízení pro sušení pod proudem dusíku se jmenuje Evaterm, nikoliv Evapoterm. 5. Pojmy „program“ a „software“ jsou víceméně synonyma, proto formulace „programů a softwarů“ působí podivně. 6. Ovládací program pro LC/MS není HP ChemStation, ale Agilent ChemStation. 7. Kap. 3.4 Reálné vzorky vod: Charakterizace odebraných vzorků je velmi strohá. Zdá se, že se v obou případech jednalo o vodu podzemní (z pramenů). Není ale jasné, zda byla analyzována voda surová nebo upravená, ani kdo odebíral vzorky; nevím, jak chápat informaci, že vzorky byly odebírány pod záštitou společnosti Moravská vodárenská. 8. Kap. 3.5.4 Optimalizované podmínky pro LC/MS analýzu: Jak může být doba analýzy sledovaných analytů 15 minut a celková doba analýzy 12 minut? Jakým způsobem byl realizován návrat na počáteční podmínky gradientu a ekvilibrace kolony? V tabulce 6 má namísto „tlak zmlžovače“ být „tlak zmlžovacího plynu“. Výsledky a diskuse: 1. Chromatogramy prezentované v této části mají nízkou grafickou kvalitu. Často se autorka odvolává na barvu záznamů v chromatogramech, ale ty jsou vytištěny černobíle. Elektronická verze ale barevné záznamy obsahuje. Podepsala autorka prohlášení o shodě papírové a elektronické verze diplomové práce? 2. U Obr. 29 není uvedena koncentrace sledovaných látek. Závislosti na Obr. 36 a dalších deklarované jako „Kalibrační křivka“ nápadně připomínají (polo)přímky. 3. Na str. 52 autorka uvádí, že k výpočtu směrodatné odchylky použila funkci SMODCH v Excelu. Podle mého názoru by vhodnější byla funkce SMODCH.VÝBĚR. 4. Na str. 55 jsou uvedeny vzorce pro výpočet detekčních limitů podle Grahama. Chybí popis jednotlivých proměnných. K seznamu použitých zkratek podotýkám, že FI není ionizace plamenem, ale polem, a že se neříká „desorpce plazmou“, ale „desorpce plazmatem“. Při celkovém zhodnocení obsahu jednotlivých částí konstatuji, že mně překvapilo, že Teoretická část řeší otázky jako transport léčiva biologickým systémem a klinická farmakokinetika, ale o výskytu makrolidových antibiotik v odpadních nebo povrchových vodách se v podstatě nezmiňuje. Kapitola Stanovení léčiv popisuje obecně metody používané k analýze léčiv, ale bez konkretizace směrem ke sledovaným látkám, uvádí principy jednotlivých metod, ale nikoliv ve vztahu k sledovaným sloučeninám. Diskuse výsledků pak v podstatě chybí, jsou zde jen prezentovány dvě tabulky s výsledky obsahující 40 údajů typu "ND" a nic jiného, ale například porovnání s hodnotami publikovanými v literatuře jsem zde nenašel. Závěrem tuto práci doporučuji k obhajobě a hodnotím stupněm uspokojivě / D.

eVSKP id 67559