Izolace DNA ze sýrů pro použití v polymerázové řetězové reakci

Abstract

Práce byla zaměřena na izolaci DNA ze sýrů pro použití v polymerázové řetězové reakci. Nejprve byl optimalizován postup homogenizace různých typů sýrů z komerční sítě, lyze buněk a izolace DNA. DNA byla izolována magnetickými částicemi a fenolovou extrakcí. Bylo prokázáno, že po zředění vzorku se DNA amplifikuje v PCR s primery pro doménu Bacteria. Dále byl optimalizován postup izolace DNA z čerstvých sýrů a z čerstvých kontaminovaných sýrů (sýry s vadou) a z jejich láků. DNA ze všech vzorků byla amplifikována v PCR. Byla prokázána přítomnost DNA domény Bacteria a kvasinkové DNA. V poslední části práce byla optimalizována příprava směsí pro PCR a amplifikace bakteriální DNA v PCR s primery se svorkou (F357-GC a R518). Vzniklé produkty PCR byly analyzovány pomocí DGGE. Bylo ukázáno, že amplikony DNA izolované ze sýrů a láků se liší jak polohou na gelu tak počtem. Větší počet pásů různé intenzity byl detegován po amplifikaci DNA z kontaminovaných láků.

This work was focused on DNA isolation from cheeses for the use in polymerase chain reaction. First, there was optimised the procedure of homogenisation of different types of cheeses from commercial sources, cell lysis and DNA isolation. DNA was isolated using magnetic microspheres and phenol extraction. It was shown that the DNA was amplified in PCR for domain Bacteria after dilution. Next, there was optimised the procedure of DNA isolation from fresh cheeses and from contaminated fresh cheeses and their pickles. DNA from all samples was amplified in PCR. The presence of DNA of domain Bacteria and yeast DNA was demonstrated. In the last part of the work, there were optimised the preparation of PCR mixtures and bacterial DNA amplification in PCR with primers with clamp (F357-GC and R518). Synthetized PCR products were analysed using DGGE. It was shown that amplicons of DNA isolated from cheeses and pickles differ in positions and numbers. Larger number of bands of different intensities was detected after amplification of DNA isolated from contaminated pickles.