Posudky závěrečné kvalifikační práce

Posudek vedoucího

Brázda, Václav

Ve své bakalářské práci se Matúš Vojsovič věnoval přípravě rekombinantních proteinů, a to konkrétně čtyř isoforem proteinu p53. Student ve své práci použil celou řadu molekulárně biologických a biofyzikálních metod, které jsou nutné pro expresi v bakteriálním expresním systému, včetně izolace DNA, transformace, kultivace, indukce a afinitní purifikace s následnou detekcí proteinů. Všechny metodiky zvládl na velmi dobré úrovni a nejenže naizoloval isoformy proteinu p53, ale také otestoval jejich transaktivační schopnosti v kvasinkovém expresním systému. Při vypracování textové části své bakalářské práce postupoval samostatně a prokázal dobrou orientaci v literatuře a řešené problematice a své výsledky dobře prezentuje. Pro úspěšné zvládnutí, prezentaci a aktivní přístup studenta hodnotím práci jako výbornou - A.

Dílčí hodnocení
Kritérium	Známka	Body	Slovní hodnocení
Kvalita zpracování výsledků	A
Interpretace výsledků, jejich diskuse	B
Závěry práce a jejich formulace	B
Využívání konzultací při řešení práce	A
Celkový přístup k řešení úkolů	A
Splnění požadavků zadání	A
Studium literatury a její zpracování	A
Využití poznatků z literatury	A

Navrhovaná známka: A

Posudek oponenta

Kroupová, Zuzana

Ve své bakalářské práce se student Matúš Vojsovič zabýval izolací a charakterizací alfa izoforem proteinu p53. Práce je logicky členěna a obsahuje dostatečně obsáhlou a podrobnou teoretickou část. Teoretická část poskytuje dostatečný vhled do problematiky proteinu p53 – zabývá se jeho strukturou, funkcí, izoformami a mutacemi. Dále jsou v úvodu práce představeny metody používané k izolaci proteinů. Pozitivně hodnotím kvalitu a množství použité literatury. V teoretické části se vyskytuje chybné označení genů a proteinů (geny se značí kurzívou). Geny jsou v textu označovány stejně jako proteiny, což znesnadňuje orientaci v textu. Praktická část je experimentálně bohatá. Student se po vyizolování plazmidové DNA věnoval ověření přítomnosti konstruktů, které následně byly použity k transformaci kompetentních buněk BL21, u kterých v textu schází informace, o jaký bakteriální druh se jedná (jedná se o kompetentní buňky bakterie E. coli). Z transformovaných buněk byly dále izolovány izoformy p53 dvěma způsoby - „laboratorním protokolem“ a komerčním kitem. Při izolaci „laboratorním protokolem“ bylo odebírání velké množství kontrolních frakcí, k čemuž směřuje moje otázka č.2. Proteiny byly detekovány kvantitativně pomocí SDS-PAGE a kvalitativně metodou Western blot. V kapitole 4.4 detekce proteinů je plytká a chudá diskuze, nicméně student se snažil popsat a zdůvodnit výskyt bandů, které nebyly jako výsledek očekávány. Krátká diskuze se objevuje na konci kapitoly 4.5. V kapitole 4.4.1 jsou znázorněny gely po barvení Coomasie blue pouze pro 3 izoformy, gel pro 160p53 v kapitole chybí. Kapitole 4.4.2 bych vytkla nízký kontrast u použitých snímků u WB (Obr.12-17), kdy v textu popisované bandy není na obrázcích možné spatřit (Obr.13). Dále by si bandy popisované v textu zasloužily zvýraznění v obrázku, ať už pomocí šipky či hvězdičky, aby se čtenář rychleji a přesněji mohl v příslušném výsledku orientovat. Formulace výsledků jsou ne vždy přesné, kdy výrazy „v prvej polohe“ nejasně popisují příslušná data (str.35). Jako celek práce působí velmi dobrým dojmem i přes výše zmíněné nedostatky. Student si při vypracování bakalářské práce osvojil mnoho laboratorních a molekulárně - biologických technik, včetně pokročilejších metod. I přes zmíněné nedostatky práci doporučuji k obhajobě a hodnotím stupněm „B“.

Dílčí hodnocení
Kritérium	Známka	Body	Slovní hodnocení
Interpretace výsledků, jejich diskuse	C
Využití literatury a její citace	A
Úroveň jazykového zpracování	A
Kvalita zpracování výsledků	B
Logické členění práce	A
Splnění požadavků zadání	A
Závěry práce a jejich formulace	C
Formální úroveň práce – celkový dojem	B

Navrhovaná známka: B

Otázky

1. V kapitole 2.6.4 zmiňujete, že endogenní exprese izoforem 160p53 byla nalezena u buněčných linií U2OS, T47D, K562. Nikde v textu dále nejsou linie popsány, o jaké buněčné linie se jedná?
2. Při izolaci proteinu pomocí lyzačního pufru bylo odebráno celkem 6 kontrolních frakcí, kdy při WB nebyla pozorována významná ztráta proteinu během jeho izolace v jednotlivých krocích. Jak si vysvětlujete, že v kontrole po indukci je dostatečně viditelný band značící přítomnost proteinu, avšak při následné eluci není přítomnost proteinu potvrzena?
3. Vysvětlete prosím, co znamená v kapitole 4.5 u grafů popis „Fold of empty“ u osy y?