TROJÁNEK, Z. Izolace DNA z rostlinných tkání pro použití v polymerázové řetězové reakci [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2013.

Posudek vedoucího

Rittich, Bohuslav

Student vypracoval diplomovou práci se zájmem o řešenou problematiku. Práce je dobře zpracována a výsledky odpovídajícím způsobem interpretovány. Student pracoval samostatně a iniciativně. Získané poznatky jsou původní a výsledky práce budou prezentovány na mezinárodní konferenci: Microbiology and Immunology of Mucosa , Kudowa Zdrój, Polsko, 28.5-31.5. 2013.

Posudek oponenta

RNDr.Roman Matyášek, CSc.

1. Na stránce 10 popisujete možnosti skladování a transportu rostlinného materiálu. Postrádám zde však jeden způsob transportu a uchování rostlinných vzorků při němž zůstává DNA a RNA po dlouhou dobu řádu dní intaktní i při běžných teplotách. 2. V závěru, kde popisujete výsledný postup při izolaci DNA, je potřeba přímo specifikovat kolik rostlinného materiálu je možno použít. Představuji si že je shora určitě omezeno. Můžete tuto horní hranici nějak specifikovat a proč je nutno o ní uvažovat? 3. Z obr. 11 a 13 bych usoudil, že pouze malá část purifikované DNA v roztoku byla vázána nosiči. Dovedete odhadnout nějakou závislost či rovnovážnou konstantu popisující vztah mezi koncentrací v roztoku a množstvím adsorbované DNA? Existuje nějaký teoretický model? 4. V diskusi 5.6.5.4. je potřeba v posledním odstavci kde srovnáváte oba nosiče uvést odkaz na výsledek banán/F-kol 135 ox který je uveden mimo tuto kapitolu (obr 19). Dále je potřeba specifikovat jestli při srovnání obou nosičů byly u banánu použity stejné hrubé izoláty protože jak je vidět např. u špenátu obr. 24 jednotlivé izoláty se mohou významně lišit a pak tvrzení že nosič F-kol 135 je lepší nemusí být opodstatněné. V tomto případě je skutečně nutno provést srovnání nosičů na naprosto stejných vzorcích. Protikladné výsledky, závislé na materiálu, získané pro oba nosiče jsou konečně patrné i z qPCR (Tab. 19) kterou opět diskutujete velmi poskrovnu. Zde by bylo potřeba aspoň zmínit že neexistuje korelace mezi hustotou karboxylových skupin a množstvím navázané DNA. To může rovněž souviset s její integritou. 5. U obr. 16 vidím slabý produkt i u běhu 2. Možná kdyby se vzorek zředil jiným poměrem mohl by být produkt u vzorku 2 mnohem patrnější. Hrubé lyzáty vzorků 1,2 a 3,4 nejsou totožné a tudíž je nelze srovnávat protože neznáme aktuální koncentraci DNA v každém lyzátu. Nevím jestli byla testována i jiná ředění. Je opravdu 1:100 to nejlepší pro přímou amplifikaci hrubého lyzátu? 6. Na str. 18 v odstavci DNA polymerása bych prosil o vysvětlení formulace ....“od 5´konce primeru... 7. Bylo by vhodné vysvětlit a nebo uvést na správnou míru tvrzní (str9,posl.ř) že v prostředí tekutého dusíku dochází k “dehydrataci” tkáně. Mimochodem u rostlin by se neměl pojem tkáň přehnaně užívat. 8. Prosím o vysvětlení pojmu „odpor vody“ na str.18. 9. Jak kyselina olejová chelatuje? 10. Opravdu byl Fenol připraven tímto způsobem (Str. 28) tj. ekvilibrací uhličitanem ? 11. Opravdu bylo použito 1000 ml vody pro přípravu TAE (Str 29)? 12. V úvodu jste postuloval, že v průběhu izolace DNA tato nesmí rozmrznout. V návodu 4.2.1. čtvrtý odstavec píšete, že „homogenizovaná tkáň byla převedena do mikrozkumavky a bylo k ní přidáno pufru AP1. Tento pufr by měl být přítomen v mikrozkumavce již před přidáním homogenátu. Nemám pravdu?. Podobně je to opsáno i v odst. 4.2.3. 13. Co myslíte tím že byla horní fáze okyselena acetátem sodným (str.34) 14. Z jakého důvodu byla použita tak vysoká koncentrace jedovatého merkaptoetanolu v návodu 4.2.5. 15. Z jakého důvodu byla použita tak nízká (50 C) teplota hybridizace primerů pro ITS1 amplifikaci (str. 39). 16. Měla intenzita (délka, opakování) promývání vliv na výtěžek DNA pomocí MN? 17. Máte představu proč na obr.15 v běhu 7 (přečištěno MN) není produkt a v opakovaném běhu 17 je ho tak málo? 18. Proč nejsou tabulky (13,14, 24 .....) umístěny celé na jednu stránku 19. U obr. 21 a 23 chybí pozitivní a negativní kontrola a přitom je v legendě uvedena. Byla provedena nebo byla legenda pouze bezmyšlenkovitě opsána z předchozích? 20. V diskusi dosti často v podstatě opakujete výsledky. Například u diskuse 5.6.4.6. konstatujete že u plodů byl nižší výtěžek DNA. Já bych se pokusil o vysvětlení. Třeba že plod obsahuje obecně velké množství vody nebo zásobních látek jako jsou cukry, tuky, bílkoviny na úkor NK. 21. Proč nebyly použity u PCR 5.6.5.2. (26S, 200 pb) všechny vzorky jako u předchozího experimentu (ITS1, 700 bp). Proč nebyl použit F-kol B na chléb?.

eVSKP id 65288