KOCIANOVÁ, V. Prekoncentrace iontových složek vzorku pomocí epitachoforézy [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2020.

Posudek vedoucího

Voráčová,, Ivona

Studentka Vanda Kocianová na své diplomové práci pracovala samostatně, iniciativně a s velkým nasazením. Zejména bych chtěla ocenit její nasazení v praktické části práce, kde si velmi rychle osvojila ovládání experimentálního zařízení vyrobeného na IACH. Značnou zručnost vyžadovala příprava gelu, jeho přenesení do zařízení a překrytí folií bez přítomnosti vzduchových kapes i plnění zařízení elektrolyty. Toto umožnilo provedení velkého množství experimentů a optimalizovat proces koncentrace a separace pomocí epitachoforézy i nad rámec původního zadání diplomové práce. Výsledky, které v průběhu vypracovávání diplomové práce studentka získala, přehledně zpracovala a vyhodnotila. Poznatky získané Vandou Kocianovou jsou nadále využívány jak při aplikaci epitachoforézy na koncentraci a separaci DNA z biologických vzorků, tak i pro koncentraci a separaci mikroorganismů z životního prostředí.

Posudek oponenta

Dvořák, Miloš

Předložená diplomová práce se zaměřovala na oblast základního výzkumu týkající se optimalizace nové originální analytické metody a v jejím rámci byly řešeny otázky klíčové pro řešení širšího celku. Z práce, popisů a jejich cílů bylo zjevné, že práce nepodala uzavřený vývoj celé metody, např. pro samostatný publikační výstup, ale prezentovaný vývoj metody zřejmě bude možný na konferenční úrovni ve formě posteru, či jako prezentace. Nicméně pro další výzkum a publikaci ve formě kvalitního impaktovaného článku působila tato práce jako klíčová. Práce odrážela vědecké trendy a potřeby aktuálního výzkumného záměru v oblasti analytické chemie. Řešila potřeby části analytické chemie v oblasti zpracování vzorku před vlastní analýzou, a to v části, kde byla v této oblasti mezera – zpracování velkého množství vzorku v řádech mililitrů pro prekoncentrační účely. Originálním způsobem se tak přibližovala ke zvyšování citlivosti metody zakoncentrováním analytů ze směru kde řada jiných technik nemá šanci protože pracuje maximálně v řádech mikrolitrů, či s velmi ředěnými vzorky. Z práce působí, že studentka prokázala velké úsilí, a značnou časovou investici při provedení experimentů. Přitom bylo znát nutnost mravenčí, trpělivé a všímavé práce, zručnost, a kvantum experimentů. Navíc spousta vyhodnocení probíhala subjektivní metodou pozorování gelů, zařízení, nosiče, a migrujících zón a to vyžadovalo schopnost to i smysluplně pochopit, popsat a formulovat z toho závěry. O to tato práce byla těžší oproti vyhodnocování exaktních dat. Z předložené práce bylo patrno, že se studentka v experimentech vyznala, zvládla je a systematicky členila a navrhovala další postupy a náležitě vše popsala. Následné sepsaní a popis experimentů a formulace závěrů byl tudíž ztížen tím, že se v práci vyskytovala řada různých přístupů, povícero jevů které bylo nutno brát v potaz, kombinační nutnost komparace vizuálních výsledků po provedení experimentů za různých vstupních podmínek a různých projevů jejich chování a dosažených výsledků samotných. To vše spělo ke značné mentální činnosti, se kterou se studentka vypořádala na poměrně dobré úrovni. Vše bylo podáváno strukturně, rozčleněno na vhodné kapitoly, části a chronologicky seřazeno. Po výčtu a znázornění všech experimentů obrázky a komentáři jsem ocenil kapitolu Závěr, kterou jsem hodnotil jako formulovaný jasný, a strukturní přehled dosažených výsledků. Oproti jiným diplomovým pracím měl větší rozsah, ale také větší vypovídací hodnotu a podal čtenáři ucelenou stručnou informaci o výsledcích s jasnými formulacemi závěrů. Vzhledem k výše psanému proto zcela chápu mírné nedostatky ve stylistice psaní, formulacích, na některých místech neobratnějšímu přístupu k podání informace a vysvětlení, či popisům. Někde jsem se mírně ztrácel, protože informace byly podávány postupně ve stylu, že vyžadovaly znalost problematiky, nebo pročtení celé práce abych bylo jasno o čem byla v některých pasážích řeč. Chtělo to na některých místech přímo odkázat, že o tom bude psáno dále, nebo přesněji a šířeji vysvětlit. Vzhledem k celkovému dojmu, naplněním cílů práce a značnému úsilí vloženého jak do experimentů i snaze vše správně podat a vyhodnotit mám za to, že studentka tak naplnila poslání diplomové práce a inženýrského studia, které prokázala trpělivostí, systematickými experimenty, navrhováním, postupy i diskusemi výsledků úvahami to vše s inženýrským přístupem a doporučuji tuto práci k obhajobě i přes drobné nedostatky, uvedenými níže a navrhuji celkové hodnocení za A = výborně. Pro další rozvoj hlavně v psaní odbornějších textů a zpětnou vazbu uvádím postřehy kterých je dobré se vyvarovat a které zbytečně srážely úroveň práce: Zahlédl jsem pár nekonzistentností v psaném textu, kdy stejné pojmy byly psány různým způsobem (př. mikroorganismů vs. mikroorganizmů), střídání přítomného, minulého a budoucího času a trpného a činného rodu, mix jednotného čísla s množným a trpným rodem (př. že práce byla dělána vs. dělaly jsme…a někde… dělala jsem…. ) V úvodní části jsem nacházel drobné popisné nepřesnosti v principech metod, které byly dány přílišným zestručněním nebo špatným podáním, takže čtenář si musí pracně domýšlet co bylo myšleno a jak kam co patří zasadit, případně některé pojmy nejsou vysvětleny vůbec, které by to zasloužily. Toto se týká hlavně str. 8-9, popisu principů, kde jsou nějaké popisné nepřesnosti u principů, dále např. str. 10 není jasné co jsou gradientní proužky, nějaké pojmy jsou zbytečně nechány anglicky když už mají zavedený český ekvivalent („moving boundary“ – pohyblivé rozhraní, str. 12). V práci byly užity správnou formou citace, umístěné na patřičných místech a práce reflektovala aktuální práce. Výhradu mám ke straně 12-13 kdy byly chabé citace jednotlivých uvedených prací historického vývoje ITP, kde citace chyběly úplně, nebo byly převzaty jen z jednoho zdroje? Pěkně je shrnuto rozdělení elektromigračních technik a kam vůči tomu patří představená epitachoforetická metoda. Nicméně je trošku na škodu, že ústřední části diplomové práce – epitachoforéze, navíc jako novější technice, byla věnována vůči ostatním popisům technik menší pozornost. Pro přehled dobré, ale chtělo to tedy vypíchnout další věci u této techniky, více znázornit rozdíly a doplnit rovnice a fyzikální procesy a zdůraznit rozdíly oproti klasické ITP či CZE, popsat možnosti a módy a chování při nich (např. módy konstantního napětí, proudu a výkonu a jejich vliv na separaci a nosič). Toto se týká stran 15-17. Doporučoval bych příště začít popisem této techniky a postupně doplňovat z čeho to vzešlo, z jakých principů, které stačí ocitovat nebo stručně zmínit, popsat více odlišnosti a procesy, tak i shrnout publikované aplikace v této oblasti udělané. Takto to bohužel působilo, jako jakýsi přílepek k technikám i když její výhoda z toho patrná byla. Na str. 20. zvýšení hladiny cfDNA asi nezpůsobí cvičení tkáně…. V experimentální části občas chyběl exaktní popis postupů a zařízení, které byly následně zmíněny ve výsledkách. Např. Str. 25. není uveden průměr a výška zařízení, a chyběly rozměry a průměry všech zařízení, aby čtenář měl představu, jak velké jsou disky a zařízení. Ani u obrázků nejsou bohužel dána měřítka. Zrovna tak chyběl popis opracování plasmou a co je vůbec O2 plasma, zmiňovaná v následujícím textu. Celkově tato Experimentální část působila místy dojmem, že autorka přesně věděla, co dělá tak spoustu věcí brala jako samozřejmost, nicméně pro neznalého čtenáře bylo dost obtížné pochopit nějaké části, souvislosti a provedení. Chválím ale obrázkové provedení, názornost a chtělo to zlepšit jen popisnou úroveň a konzistenci a systematičnost textu. Tato nekonzistence se např. projevila hlavně plácnutím kapitoly 4.1.3. kde nebylo jasné na co to navazuje, k čemu to je a kde se to používá. Chtělo to nějakou větou uvést. V textu jsem si povšiml pojmů, které nebyly předem vysvětleny - např. v úvodní části byla řeč o elektroosmóze a najednou se objevil termín elektroendoosmóza. To trochu mátlo, byť je to do určité míry samovysvětlující. Str. 27. typický zástupce střídání mluvnických rodů přidáme… naplníme a v dalším odstavci…byl připraven….. doporučuji celou práci tedy psávat jednotně v trpném rodě jednotného čísla rodu středního, času minulého. str. 29 je informace o získaném objemu DNA vážením. Nicméně vážením získáme váhu. Jak byla přepočítána váha na objem jsem se nedočetl. Výpočet byl realizován přes hustotu? nebo jakým způsobem? Jako velmi pozitivní a vysvětlující hodnotím uvedení příkladů výpočtů které upřesňovaly význam popisů a jejich použití, neboť někde díky chybějícímu vysvětlení text působil tak že reprodukování experimentu dle psaného by mohlo být obtížné. Str. 39-40.: Uváděný je rozsah koncentrace agarózy 1-2 % Není jasné proč nebyly zkoušeny nižší/vyšší koncentrace, a proč padla volba zrovna na 1,3 % což je hodnota neobvyklá. Souhlasím a je pěkně poznamenáno a přiznáno že to bylo díky experimentální chybě a vedlo to k výraznému zlepšení chování, nicméně nezasloužilo to větší pozornost např. otestování 0,5%, 1% , 1,3%, 1,5%, 1,8% , 2% 3%, 5% agarózy a osvětlit co se děje při různých % agarózy za změny a která je již nevýhodná a proč? Str. 43.: 4 mL soli působí dosti slangově – nepřesná formulace a není jasné zda je tím myšleno 4 mL 0,9% rozoku NaCl? Str. 44.: Objevuje se termín „opracování plasmou“ nikde předtím o ní není ani zmínka jak, co to znamená, jak bylo provedeno, jakým zařízením. Str. 48.: Testování změny koncentrace LE/TE: Chyběla mi informace když se testovalo vzájemně stejná koncentrace a pak jeden případ kdy LE byl koncentrovanější oproti TE co se děje kdyby byl TE koncentrovanější oproti LE. Navíc tato stať nemá jasný výsledek, nebo vysvětlení, že nějaká jiná(původní?) koncentrace byla nejoptimálnější. Str. 60.: Jak si má čtenář vyložit pojem „spálení“ skupin? Jde o myslím terminologicky chemicky nevhodný pojem. Jde o oxidaci, či mechanické opálení, karbonizaci (což je oxidace)? Str.61.: Nešťastně působí formulace a přiznání že výtěžnost představené analytické techniky silně závisí na zručnosti pipetování. V tomto případě, oceňuji doznání autorky, nicméně v tom případě tato činnost měla být zajištěna kvalifikovanější osobou, jinak to působí trošku devalvačně. Navíc nedává dobré světlo na robustnost metody a nutnost mít patřičně zaškolený personál s dostatečnou praxí. Nicméně to vysvětluje nízké výtěžnosti a kladně hodnotím ukázku tabulky jakých výtěžností dokáží mít osoby s praxí. Chtělo to více okomentovat, určit např. robustnost metody na základě více osob, opakovatelnost, nebo si dát práci s naučením se pipetovat malé objemy a ověřovat zda byly kvantitativně odebrány. Na druhou stranu, kvantitativní výsledky nebyly rozhodně předmětem a cílem práce, takže autorka svou část práce (optimalizace nosiče) odvedla výborně a to že se nějaký dílčí krok někomu nedaří (pipetování DNA) jen dokazuje že různí lidé jsou nastaveni na různé věci a je dobré to přiznat – v diplomové práci to je spíše kladné. V odborných publikacích je toto nepřípustné. Nicméně samotná věta je nelogicky podaná: „Výtěžnosti jsou nízké, protože …vyžadují zručnost…“ Výrokově nesedí. To je spíše projekce a důvod a vyvolává další dotaz a připomínky proč není detailně popsáno odebírání DNA z kalíšku, když je to takový náročný krok. Pojem „hydrofobita“ užívaný v této práci. Mám, možná subjektivní, dojem, že tento termín značí něco jiného, nebo je užíván minoritně či nesprávně a že typický zaužívaný pojem který zde měl být je „hydrofobicita“ Str. 69.: Zde je ve větách nevhodný mix pojmu „teflon“, což je obchodní označení Polytetrafluorethylen. Navíc mne tento odstavec uvedením zkratky zmátl, a působilo rušivě…proč nejsou zkratky uvedeny i u ostatních (PP, PET,…)…předpokládám že jde v tomto odstavci o souhrn pozorování na různých polymerních nosičích? Doporučením je konzistentně uvést název, jeho zkratku a pak již jen jeden způsob po celou dobu textu. Výtěžnosti uváděné autorkou, s ohledem na méně zručný odběr se pohybují do 30%. Je to pro účely další práce dostatečné natolik aby i méně zkušený operátor mohl provozovat tuto metodu a stačilo mu výtěžnost např. 7-30% co uvádíte?

eVSKP id 124071