Posudky závěrečné kvalifikační práce

Posudek vedoucího

Kuchta, Tomáš

Navrhovaná známka

Posudek oponenta

Hanák,, Petr

Předložená práce se zabývá problematikou detekce tří rostlinných alergenů – pistácií, mandlí a sóji v potravinách. Použita byla metoda Real Time PCR, která deteguje vybraný marker z genomu dané rostliny a ten používá jako průkaz přítomnosti, případně množství, dané komponenty. Právě Real Time PCR přináší možnost kvantifikace, což však je u potravinových alergenů zatím spíše sporadicky se objevující výstup. Potravinové alergie je možné i přes zjevnou biologickou příčinu řadit do skupiny civilizačních chorob především pro jejich narůstající incidenci. To souvisí i s mezinárodním obchodem s potravinovými komoditami, v poslední době doslova v globálním měřítku. Dobře to dokumentuje výskyt alergie na kiwi u dětí, který v západní Evropě se zpožděním odpovídajícím přesně období senzitizace nastoupil s importem tohoto ovoce. Navíc se posouzení možné alergenicity stalo rutinní součástí i hodnocení u jakékoliv geneticky modifikované potraviny, resp. plodiny. Předkládaná práce tak řeší vysoce aktuální problematiku. Je tudíž v předložené práci uchopen naprosto reálný problém i na úrovni dalšího rozšiřování stavu poznání. V tom je třeba spatřovat její největší přednost, kdy zároveň předkladatel samostatně zvládnul poměrně dlouhou řadu náročných metodik, v rozsahu, který je spíše výjimečný než běžný. Výzkumné téma je tedy v souladu s tím definováno a pojato správně a tomu odpovídá i zvolený postup. I při zasazení cílů práce do kontextu jiných disertačních prací je třeba znovu konstatovat, že předkládaná práce reprezentuje metodicky značně náročné zpracování problematiky, která není zatím vyřešena buďto vůbec, nebo pouze útržkovitě. To s sebou nese i riziko možného nedosažení výsledku, což v tomto případě nastalo ze tří potravinových alergenů (pistácie, mandle, sója) pouze u jednoho - mandle. Podstata vědecké práce však v sobě zahrnuje komponentu nejistoty a tak lze jen ocenit, že i přes možná rizika byla tato problematika zvolena jako téma disertační práce, která tak přesně odrážela „hmatatelně“ reálný výzkum. I přes tuto nejistotu bylo dosaženo výsledků, které jsou originální, kdy jak u pistácie tak u sóji byla vyvinuta kvantitativní stanovení na bázi Real Time PCR, splňující kritéria exkluzivity (negativní výsledek u příbuzných druhů) a inkluzivity (pozitivní výsledek v rámci genetické variability např. různých odrůd v rámci stanovovaného druhu). Lze tak v tomto uzavřít, že předložená práce splnila zadání. Jako vysoce přínosné je na předložené práci také třeba vyzdvihnout, že představuje jeden z prvních pokusů o posun detekce potravinového alergenu pomocí PCR na kvantitativní úroveň, právě díky použitému formátu Real Time PCR. Práce i s přílohami svými 170 číslovanými stranami a vloženými 32 obrázky a 42 tabulkami splňuje rozsah potřebný pro dostatečné prezentování zkoumané problematiky. Text je vybaven 51 citacemi, kdy jejich rozsah i výběr odpovídají potřebám práce. Citace zahrnují jak starší odkazy, představující stěžejní zdroje, tak ale i poměrně recentní citace. Drobnou výtku zasluhují občasná vybočení z jednotného formátu citování u některých konkrétních citací. Vedlejším, přesto však mimořádně cenným, přínosem je odhalení falešné negativity v případě konkrétní odrůdy u komerční soupravy na detekci mandlí. Znalost takového „slabého místa“ komerční soupravy má zcela konkrétní důsledek, neboť pro alergika s potravinovou alergií na mandle může mít takto získaný nesprávný výsledek poměrně kritický dopad. To snad zmírňuje jen skutečnost, že mandle s vysokým obsahem amygdalinu, což nejspíš bude i případ odrůdy „bitter 2“, nejsou na českém trhu povoleny. Souhrnem lze zhodnotit práci předloženou ing. Jiřím Šmídem jako vědecký materiál odrážející vysoce náročnou výzkumnou práci, u které byly správně stanoveny cíle a těch bylo z většiny dosaženo. Neoddiskutovatelným je praktické použití výsledků práce v analýze potravin na přítomnost daných alergenů, stejně jako však práce buduje základy pro pokračování samotného výzkumu na tomto poli. Lze jen litovat nepatrného snížení jinak vynikající úrovně práce několika drobnými nedostatky v jejím literárním, resp. finálním zpracování. Ze všech výše uvedených důvodů práce splňuje kritéria kladená na disertační práci k udělení titulu philosophi doctor (Ph.D.)

Navrhovaná známka

Otázky

V úvodu na str. 9. spojení „nedokonalostí trávit“ je zkratkovité nad stylisticky přijatelnou úroveň. Měla být raději použita výstižnější formulace, např. „nedokonalou schopností trávit“.
Podobně na str. 15. spojení „vzhledem na výhody“ by nejspíše odpovídalo slovenštině a správnější by bylo použít „vzhledem k výhodám“ a nebo případně „s ohledem na výhody“.
Na str. 10 je pistácie správně řazena do čeledi Anacardiaceae, která však nenese české označení „ledvinovité“ ale ledvinovníkovité (popřípadě vzácně ledviníkovité). Jedná se o čeleď z řádu mýdelníkotvarých (Sapindales). I zde se jedná o ryze formální výtku, neboť při testování metody na exkluzivitu byly do kontrolního panelu zcela správně zařazeny plody i právě druhů z čeledi ledvinovníkovitých – konkrétně kešu ořechy
Jisté výhrady lze mít i vůči označení „píniové ořechy“ na str. 12, byť se jedná o občas používané pojmenování. U nahosemenných rostlin by však asi bylo lépe používat přeci jen označení „piniová semínka“.
Poznámka k teoretické části, str. 14.: Principielně může být pro detekci potravinového alergenu pomocí ELISA použita i monoklonální protilátka. To je potom v textu uvedeno dále.
K debatě o specifičnosti protilátky použité v imunochemických metodách a možné odlišnosti jí rozeznávaného epitopu/epitopů od těch, které vyvolávají v disponovaných jedincích – konzumentech alergickou reakci je snad na místě poněkud futuristická poznámka, že do budoucna lze možná očekávat i shodu mezi těmito dvěma epitopy díky nově nastupujícím technologiím typu „phage display“. Je v tomto kontextu velkým přínosem předkládané práce, že vedle řešené problematiky detekce založené na molekulárně-biologických principech zmiňuje celkem detailně i imunochemické přístupy, neboť tyto zmiňované nejmodernější technologie jsou svého druhu syntézou obojího.
Na str. 25. - v češtině je >vzorek
Na str. 26. se věta „Takovéto přístroje se vyrábějí a používají už několik let a také se začínají krystalizovat určité technické řešení.“ přibližuje v důsledku neobratnosti formulace na samou hranici srozumitelnosti. (Nejspíš mělo být „...a také začínají krystalizovat určitá technická řešení.“)
Na str. 26. by v podkapitole 2.7 Termocklery možná měla být zmínka o fyzikální podstatě termobloku – tedy polovodičovém Peltierově článku, když výklad zachází až na úroveň jiných technických detailů, resp. úprav.
Ve výčtu fluorescenčních detekčních systémů u Real Time PCR není zmínka o modifikaci prób - MGB. Bylo by možné uvést jejich výhody a nevýhody a případně i specielní aplikace (mimo oblast výslovně detekce potravin) pro které jsou díky svým vlastnostem výhodné?
Na str. 37. je používán termín „barvivo“ a jen o pár řádek níže slovenský výraz, který však v češtině neexistuje, „farbivo“.
Na str. 38. jsou jako konfirmační postupy u PCR v end-pointovém formátu uvedeny Southern blot, sekvenování a RFLP. Je možné uvést příklady provádění konfirmace pomocí RFLP nebo Southern blotu u nějaké PCR z potravin? Southern blot rozhodně našel místo při analýzách v rámci poměrně specifické kategorie potravin, resp. jejich zdrojů. Je předkladateli známo o jakou kategorii plodin se jedná a co se za použití metody Southern blot sleduje?
Jak u soji (str. 46.) tak u pistácie (str. 50.) se uvádí, že systém primerů a próby byl navržen tak, aby nebyl homologní s příbuznými druhy rostlin. Jak konkrétně tento postup vypadal a příp. jak byla vymezena skupina příbuzných rostlin?
Obrázek 13. na str. 51. zobrazuje m.j. reversní primer PSTCR7 a červeně je vyznačena poloha intronu. Dle textu na str. 50. byl tento reversní primer navržen právě s ohledem na objevení intronu. Podle obrázku a uvedené sekvence v tabulce 11. na str. 50. by ale intron měl zasahovat do sekvence primeru a jeho antiparalelní sekvenci přerušovat (?). Nebo v připojeném obdélníku pokračuje za sekvencí reverzního primeru sekvence intronu, zatímco v hlavním obrázku pokračuje za červenou značkou sekvence vlastního genu, bez intronu?
V tabulkách jednotlivých MasterMixů (str. 48., 49., 52.) je v posledním řádku namísto symbolu pro celkový objem nesprávně symbol čtverce, což zpočátku způsobuje nedorozumění.

Timko,, Jozef

Predkladaná dizertačná práca bola vypracovaná na Vysokém učení Technickem v Brne na Fakulte chemické a Ústave chemie potravin a biotechnologií. Aj keď ciele práce nie sú uvedené v samostaatnej kapitole sú tieto ciele jasne zadefinované v zadaní dizertačnej práce. Ide o vyvinutie a overenie metód na identifikáciu potravinových alergénov a to tak rastlinného ako aj živočišného pôvodu, za použitia PCR. Ide o veľmi aktuálnu tému, pretože alergia na niektoré zložky potravy je dosť častá, najmä u deti a v určitých prípadoch aj dosť nebezpečná a niekedy môže končiť aj úmrtim. Okrem gnozeologického hľadiska práca má aj veľký praktický význam, najmä vzhľadom na vyššie uvedené. Práca má klasické členenie je dobré napísaná a dobré sa číta. Oceňujem, že obsahuje aj informácie o autorovi a jeho publikačnej činnosti. Po „Úvode“ nasleduje „Teoretická časť“, kde na 27 str. sa autor venuje potravinovým alergiám, izolácii a purifikácií DNA, princípom a charakterizácií PCR, principu a charakterizácii real-time PCR, zložkám reakčných zmesi PCR, teplotnému programu, termocyklerom, protikontaminačným opatreniam, zábranou inhibície PCR, parametrom real-time PCR, kontrole priebehu real-time PCR, identifikácií zložiek potravin s použitím real-time PCR, florescenčným detekčným systémom real-time PCR, detekcii produktov PCR a faktorom ovplyvňujúcim amplifikáciu nukleových kyselín. Ide o veľmi dobre spracovanú kapitolu, ktorá svedči o dobrej teoretickej príprave autora v danej problematike. Nasleduje kapitola „Materiál a metódy“ , kde doktorand popisuje materiál a to sóju, pistácie a mandle zvlášť ako aj všetky použité metódy, prípravy vzoriek, izolácie a purifikácie DNA, inzerciu PCR produktu do plazmidu pDrive až po transformáciu prislušných buniek. Rovnako táto kapitola je spracovaná na veľmi dobrej úrovni a v súlade so stanovenými cieľmi práce. Dosiahnuté výsledky práce sú prezentované na 20 str. textu v kapitole „Výsledky“ , ktoré sú podložené 19 obrázkami a 9 tabuľkami. Niektoré tabuľky presahuju jednu stranu, čím chcem zdôrazniť, že ide o množstvo nameraných údajov, ktoré boli náročné aj na prevedenie. Dosiahnuté výsledky sú veľmi dobré a prehľadne spracované. Za veľmi dobrý výsledok pokladam, že sa podarilo vyvinuť detekčnú metódu pre pistácie v potravinách. Na základe prezentovaných výsledkov, ich spracovaniu,diskusie a publikačnej činnosti môžem konštatovať, že práca spĺňa v plnom rozsahu kritéria na doktorandské dizertačné práce. Rozsahom dosiahnutých experimentálnych výsledkov, autor preukázal koncepčnosť a systematičnosť svojho snaženia. Na základe uvedeného hodnotenia konštatujem , že Ing. Jiři Šmíd spĺňa všetky požiadavky, aby po úspešnom obhájeni práce a podľa príslušnej vyhlášky o doktorandskom štúdiu mu bol udelený vedecko-akademický titul

Navrhovaná známka

Otázky

Na str. 69. Uvádzate, že 3 vzorky mali deklarovaný obsah sóje. Vy ste ich nedetekovali. Mate na to nejaké vysvetlenie?
Prečo ste práve tieto 3 vzorky(svačinková pomazanka, dedinská pašteka, svačinka) nepodrobili aj kvantitatívnemu stanoveniu soje?
V čom vidite príčiny neamplifikácie DNA mandli? (je správny výraz sekvenovanie, alebo sekvencovanie, jedno aj druhe ste použili).
Mate nejaké vedomosti o tom, či sója bola GMO, alebo nie?
Budú Vami navrhované metódy aj využité v praxi, alebo zostanu len na gnozeologickej úrovni?