VRŠANSKÁ, M. Studie aktivity extracelulárních enzymů produkovaných různými druhy kvasinek [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2014.

Posudek vedoucího

Voběrková, Stanislava

Studentka Martina Vršanská se v rámci své diplomové práce zabývala studiem produkce lipolytických a proteolytických enzymů u vybraných kmenů kvasinek. Studentka svědomitě plnila úkoly vyplývající se zadání diplomové práce. Provedla velké množství experimentů přesahujících požadavky diplomové práce a projevila značnou flexibilitu při jejich provádění. Získané výsledky samostatně zpracovala a interpretovala. Kladně také hodnotím její účast na zahraniční stáži, při níž se seznámila s dalšími experimentálními technikami.

Posudek oponenta

Ing.Jana Molnárová, Ph.D.

Predložená diplomová práca je zameraná na štúdium produkcie lipolytických a proteolytických enzýmov vybranými kmeňmi kvasiniek.U kmeňov druhov Yarrowia lipolytica, Meyerozyma guilliermondii a Pseudozyma fusiformata boli stanovené enzýmové aktivity a preskúmaný vplyv rôznych faktorov na produkciu enzýmov. Následne bola u kmeňa Y. lipolytica porovnaná lipolytická a proteolytická aktivita pri vsádkovej a kontinuálnej kultivácii. Práca je podložená dostatočným množstvom citácií a obrázkov. Má primeraný rozsah strán a zahŕňa množstvo výsledkov. Mám však pripomienky ku prehľadnosti práce a autorka sa dopustila viacerých nepresností. Uvádzam najzávažnejšie z nich: Str. 11: Ciele práce - v experimentálnej časti nie je spomenuté stanovenie proteolytickej aktivity, ciele práce majú byť zadefinované jednoznačne a prehľadne. Str. 12: Teoretická časť - nie je dostatočne prehľadná, hlavne prvá časť. V kapitole 3.1 - sa informácie opakujú, nie sú vždy písané v logickej nadväznosti, určité údaje sú uvedené veľmi všeobecne, inokedy zase autorka zachádza do zbytočných podrobností, ktoré nesúvisa s jej prácou (napr. zhoda kvasiniek s cicavčími bunkami, produkcia hydroxicinamát dekarboxylázy...) Str. 15 - výskyt a význam kvasiniek v prírode - autorka uvádza, že sa vyskytujú vo vode a v pôde. Kvasinky sa však vyskytujú aj vo vzduchu a na podzemných aj nadzemných častiach rastlín. Str. 16 - 3.2.3 Podkapitolu "Vsádková a kontinuální kultivace" by bolo vhodnejšie zaradiť za podkapitoly 3.2.4 Lipázy a 3.2.5 Proteázy. Str. 19 - autorka nesprávne formulovala literárny odkaz: ,,...avšak kvasinky rostou na pevných substrátech jen zřídka, zpravidla bývají kultivovány pomocí submerzní fermentace (41)...“ - Vo všobecnosti kvasinky na pevných substrátoch rastú veľmi dobre (napr. na sladinovom agare). Str. 20 ,, Extracelulární lipázy z kvasinek Candida, Geotrichum, Trichosporon a Y. lipolytica se purifikovaly,....“ chýba ,,rod" Candida, Geotrichum atď. a druh Y. lipolytica. Str. 28 - Zoznam chemikálií je uvedený nejednotne - niekedy je uvedený výrobca aj krajina, inokedy len výrobca. Str. 31 - príprava tlmivých roztokov - chýba citácia. Str. 32 - 0,5 mM Folin-Ciocalteuovo činidlo (F-C činidlo) - nie je uvedené, z akých chemikálií je zložené. Str. 33 - autorka udáva zloženie média: ,, Bazální médium: pepton (5 g/l), MgSO4 (0,1 g/l), K2HPO4 (1 g/l)“ - v diskusii občas píše aj o kvasničnom extrakte (aj v kapitole 4.1.1 Chemikálie je vypísaný). Aké bolo skutočné zloženie daného média? Str. 33 - autorka píše: ,, Kvasinková kultura byla z šikmého masopeptonového agaru převedena do zkumavky se sterilní vodou...“ Na kultiváciu a uchovávanie kvasiniek sa používa napr. sladinový alebo YPD agar, mäsopeptonový agar sa používa na kultiváciu baktérií! Autorka počítala bunky v Burkerovej komôrke, avšak nikde neuvádza, aká bola počiatočná koncentrácia kvasinkových buniek na počiatku kultivácie. Str. 39 Vzorec pre výpočet lipolytickej aktivity - z rovnice ktorej kalibračnej krivky je odvodený? Kde je vo vzorci brané do úvahy riedenie? Str. 43 pri stanovení proteolytickej aktivity nie je jasné, či sa stanovovala v supernatante, alebo inej časti. Str. 44 ,,Meranie pH kvasiniek“ - kvasinkám sa pH nemeria, prosím vysvetliť, čo tým autorka myslela a z akého dôvodu to bolo stanovené. Vsádková kultivácia - nie je opísaná v metódach, podmienky kultivácie sú uvedené až vo výsledkoch a diskusii! Str. 53 ,, Na sekreci lipolytických enzymů i extracelulárních proteinů mohou mít vliv proteolytické enzymy, které katalyzují hydrolytické štěpení proteinů. Jejich produkce byla detekována u všech testovaných kmenů kvasinek.“- nezrozumiteľná formulácia. Str. 58 ,, Nejvyšší lipolytická aktivita u všech tří kmenů byla pozorována v bazálním médiu s Tweenem za pouzití substrátu p-nitrofenyllaureátu“ - nie je uvedené, aký Tween bol použitý, ani v kapitole Záver nie formulácia presná. Str. 57, Graf 17 - druhy Y. lipolytica a M. guilliermondii boli kultivované v médiu s rovnakým zložením. Z grafu však vyplýva, že sa pH kultivačných médií vzájomne odlišujú. Čím je spôsobená táto disproporcia? Str. 59: Graf 18 nie je dostatočne opísaný. Je chybne uvedené, že u druhu Ps. fusiformata sa stanovila najvyššia lipolytická aktivita pri kultivácii v médiu obohatenom o Tween 80, správne je Tween 60. Str. 69, Graf 29 - Na začiatku pokusu nemala vsádková a kontinuálna kultivácia rovnaké pH kultivačného média (4,8 a 6), a ani neprebiehali za rovnakých podmienok (použité rôzne objemy média). Výsledky preto nie je možné porovnať. K práci mám aj nasledovné otázky: - Tepelná stabilita enzýmov sa sledovala pri 40 °C, z akého dôvodu? - Vzájomne porovnajte výhody a nevýhody vsádkovej a kontinuálnej kultivácie. Z predloženej diplomovej práce je zrejmé, že diplomantka urobila v laboratóriu množstvo experimentálnej práce, avšak vyhodnotenie a interpretácia výsledkov je na slabšej úrovni. Napriek uvedeným pripomienkam konštatujem, že diplomová práca splnila cieľ s ohľadom na získané výsledky. Na základe uvedeného navrhujem prácu prijať k obhajobe a hodnotím ju známkou “C”.

eVSKP id 72786