TRACHTOVÁ, Š. Studium reverzibilní adsorpce nukleových kyselin na pevných nosičích [online]. Brno: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická. 2011.
Vyjádření školitele k průběhu doktorského studia Ing. Štěpánky Trachtové Ing. Štěpánka Trachtová zahájila doktorský studijní program Chemie a technologie potravin (P2901) ve studijním oboru Potravinářská chemie (2901V021) na Ústavu chemie potravin a biotechnologií, Fakulta chemická, Vysoké učení technické v Brně dne 25. 6. 2007. Vypracovala dizertační práci na téma “ Studium reverzibilní adsorpce nukleových kyselin na pevných nosičích“. Při řešení problematiky získala některé významné poznatky o adsorpci genomové DNA na povrchu magnetických nosičů, modifikovaných karboxylovými skupinami, v přítomnosti vysoké koncentrace chloridu sodného o polyethylenglykolu. Uvedených poznatků bylo využito při izolaci genomové DNA z komplexních vzorků obsahujících inhibitory PCR. Kvalita eluované a přítomnost cílové DNA byla ověřena pomocí PCR a PCR v reálném čase. K izolaci DNA byly použity i nanočástice manganatého peroskvitu La0.75Sr0.25MnO3 pokryté vrstvou silikagelu a termosenzitivní poly(N-isopropylakrylamid). Nově byla PCR v reálném čase použita pro testování inhibičního vlivu nanočástic na průběh PCR. Výsledky práce byly publikovány ve dvou mezinárodních impaktovaných časopisech (v jedné práci je studentka uvedena jako první autor), dvě práce byly publikovány v tuzemském časopise a 2 práce v recenzovaných domácích časopisech. Další práce je v recenzním řízení v mezinárodním imputovaném časopise. Kromě toho byly výsledky získané během řešení disertační práce prezentovány formou 4 přednášek, 14 plakátových sdělení na mezinárodních vědeckých konferencích a 6 plakátových sdělení na konferencích v ČR. Během doktorského studia se Ing. Štěpánka Trachtová podílela v předepsaném rozsahu na výuce a složila všechny předepsané zkoušky. V roce 2008 absolvovala studijní stáž na Universitě v Ljubljaně, Biotechnologická fakulta, Ústav Zootechniky, Domžale, Slovinsko a v roce 2009 studijní stáž na Universitě Pannonia, Veszprem, Maďarsko. Dále absolvoval 4 studijní kurzy v ČR. V roce 2010 získala na Studentské odborné konferenci Chemie a společnost, která se konala v Brně, první místo v sekci doktorských studijních programů za přednášku: Lanthanum Manganese Peroskvite Nanoparticles for Molecular Diagnostic Application. V roce 2010 Ing. Štěpánka Trachtová úspěšně obhájila grantový projekt FRVŠ - Moderní genetické diagnostické metody v molekulární biotechnologii (1369/2009/G4). Během studia Ing. Štěpánka Trachtová musela při řešení problematiky zvládnout řadu nových metod a postupů a vyřešit řadu odborných problémů. Ing. Trachtová zavedla na pracovišti metodu PCR v reálném čase. Při zvládání uvedených problémů projevila značnou vytrvalost, pracovitost, výrazné pracovní nasazení a zájem o řešenou problematiku. O získané metodické poznatky se ochotně dělila s dalšími studenty bakalářského a magisterského studia. Průběh doktorského studia Ing. Štěpánky Trachtové hodnotim velmi kladně a proto doporučuji kladné vyřízení její žádosti o doktorské řízení. V Brně 30.8.2011 Doc. Ing. Bohuslav Rittich,CSc.. školitel Ústav chemie potravin a biotechnologií
Předkládaná disertační práce představuje ucelený vědecký spis, který je členěn do obvyklých předepsaných kapitol a který je doplněn 28 přehlednými tabulkami a 32 obrázky v podobě fotografií, schémat a grafů. V seznamu použité literatury je uvedeno celkem 112 autorských citací či elektronických citačních zdrojů. Součástí práce je i plné znění celkem pěti vybraných publikací autorky na řešené téma. Práce se zabývá možnostmi využití různých druhů magnetických i nemagnetických nosičů při studiu reversibilní adsorpce nukleových kyselin a následnými možnostmi uplatnění těchto metod v molekulární diagnostice na bázi polymerázové řetězové reakce (PCR). Doktorandka si zvolila velmi aktuální, zajímavé a náročné téma, které svým významem a možnostmi praktické aplikace nabízí široké uplatnění i napříč biomedicínckým spektrem. Dílčí cíle práce jsou jasně a srozumitelně formulovány a jak vyplývá z dosažených výsledků, byly splněny. Materiálové a metodické zázemí práce je široké, vhodně zvolené a odpovídající vytýčeným cílům. Současně vypovídá i o velmi dobré orientaci autorky v dané problematice a laboratorní erudici. Doktorandka nejprve vycházela z klasických kultivačních postupů nezbytných pro její další analýzy (Lactobacillus gasseri K7, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 216/06, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 21/06; Bifidobacterium longum, Bacillus subtilis CCM 1999, Bacillus cereus CCM 2010 , Bacillus licheniformis CCM 2145 T, Bacillus circulans CCM 1611, Bacillus megaterium CCM 2037, Bacillus mycoides CCM 915 a Bacillus thuringiensis CCM 19 T. Navázala přípravou hrubých lyzátů z jednotlivých studovaných substrátů (bakteriální kultury, mléčné výrobky, myší exkrementy obohacené o probiotický kmen Lactobacillus gasseri K7 a komerční preparát SanyDuo) a testovala a porovnávala nejvhodnější DNA izolační postupy (fenolovou extrakci a srážení etanolem, izolaci DNA komerčními kity, izolaci komerčními magnetickými částicemi a metodu magnetické separace). V další části své experimentální práce optimalizovala metody reversibilní adsorpce DNA na pevných nosičích (nejprve testovala pořadí komponent separačních směsí, dále vliv molekulové hmotnosti a koncentrace polyetylenglykolu, vliv koncentrace polyetylenglykolu a NaCl) poté optimalizovala podmínky eluce DNA z nosičů (doba eluce, vliv teploty eluce a pH elučního pufru) a podmínky magnetické separace za použití nosičů peroskvit. Amplifikovatelnost DNA izolované magnetickými nosiči z různých typů vzorků pak ověřovala konvenční polymerázovou reakcí (PCR) a PCR v reálném čase (pro kvantifikaci izolované DNA byla použita metoda absolutní kvantifikace). Ve své práci věnovala i pozornost studiu možných inhibičních vlivů jednotlivých magnetických nosičů na průběh amplifikace. Vrcholnou pasáží předkládané práce je, z mého infektologického pohledu, pak metoda rozlišení živých a mrtvých buněk působením ethidium monoazidu v porovnání s propidium monoazidem v mléčných výrobcích. Mimořádně rozsáhlá experimentální část přinesla množství získaných hodnot a údajů, které se doktorandce podařilo přehledně utřídit, vytvořit pracovní hypotézy a formulovat odpovídající závěry. Výsledky jsou zpracovány formou komentářů k publikacím uvedených v kap „Přílohy“ a důsledně diskutovány za každou dílčí etapou práce. Promyšlenou a pečlivou analýzou dosažených výsledků Ing. Trachtová dospěla k řadě velmi významných zjištění, které výrazně posouvají současnou úroveň znalostí v této oblasti: - Optimalizace podmínek metody reverzní imobilizace DNA na pevné fázi (nejvyšší výtěžnosti DNA bylo dosaženo v prostředí 16% PEG 6000 a 2M NaCl a při ověřeném pořadí komponent separační směsi). Shodné výsledky poskytly i některé další testované typy nosičů. - Interference magnetických nosičů v PCR Nadějných výsledků doktorandka dosáhla při použití nanonosiče manganatého peroskvitu i u termosenzitivních nosičů, které neovlivňovaly amplifikaci DNA v PCR. - Aplikace magnetických nosičů při izolaci DNA z reálných vzorků Ing. Trachtová prokázala, že navržená metoda reverzibilní imobilizace DNA na pevné nosiče je vhodná pro izolaci DNA z komplexních vzorků obsahujících inhibitory PCR. Je spolehlivá při purifikaci produktů PCR před následnou analýzou jinými molekulárně-biologickými metodami. - Reversibilní adsorpce DNA na peroskvit Autorkou vyvinutý postup izolace DNA byl úspěšně aplikován na izolaci DNA z reálných vzorků testovaných v předkládané práci. Izolovaná DNA byla vhodná v kvalitě i množství pro detekci metodou PCR i PCR v reálném čase. - Reverzibilní adsorpce DNA na termosenzitivní nosiče DNA je ve vyšší koncentraci na nosiče adsorbována při vyšší teplotě (40 °C). Současně autorka prokázala, že testované typy termosenzitivních nosičů jsou vhodné pro izolaci genomové bakteriální DNA z hrubých lyzátů buněk připravených z komplexních vzorků i z čisté bakteriální kultury pro následnou detekci metodou PCR. - Optimalizace metody EMA-PCR a využití magnetických nosičů Ing.Trachtová prokázala, že tato metoda je vhodná pro detekci živých a mrtvých buněk v potravinových výrobcích. Zjištěné výsledky mají výrazně interdisciplinární charakter a významně rozšiřují možnosti moderní metodologie. - V „Abstraktu“ ve 2. odst., 2. ř. uvádíte dvakrát za sebou označení P(HEMA-co – GMA), v angl „Abstractu“ to již máte správně. - Překlepy, chyby v interpunkci či gramatické chyby („lypolitycké“, reagencie sami“, ochranou, quanin, difůze, single strange DNA, apod.) - Nepřesnosti v terminologii („Bacillus subtulis) - V kap. 6.2 uvádíte, že optimální koncentrace PEG je PEG 6000 o koncentraci 12 a 16%, v kap. 6.4. a v Tab. 14 je však uvedena koncentrace PEG 6000 8 a 16%. Která hodnota je správná? - V kap. 11 uvádíte, že EMA může pronikat přes buněčnou membránu některých bakteriálních druhů. V „Literárním přehledu“ však používáte termín „bakteriální stěna“ – co je správně? - Pro disertační práci nezvyklé číselné označení citovaných autorů v textu. Obvyklejší bývá uvedení jména autora a rok zveřejnění v textu a v kap. „Použitá literatura“ pak jejich abecední řazení - U převzatých obrázků bych doporučovala uvést celým jménem (názvem) zdroj, ne pouhý číselný odkaz na autora v „Použité literatuře“. Předkládaná disertační práce je zpracovaná po formální i obsahové stránce velmi pečlivě a na vysoké odborné úrovni. Jsou z ní zřejmé hluboké znalosti a intenzívní zájem doktorandky o řešenou problematiku. Dosažené výsledky přinášejí řadu nových poznatků a významným způsobem tak přispívají nejen k rozšíření informací v daném oboru, ale mohou být využitelné i v řadě biomedicínských oborů. Doktorandka jednoznačně prokázala, že se výborně orientuje ve zvolené problematice, a proto d o p o r u č u j i , aby disertační práce Ing. Štěpánky Trachtové byla přijata k obhajobě.
Zvolené téma dizertační práce je velmi zajímavé a aktuální. Souvisí se sílícím rozvojem využití molekulárně biologických metod nejen ve výzkumu, ale i v potravinářské praxi k identifikaci mikroorganismů a k průkazu jejich přítomnosti v potravinách v kladném i záporném smyslu. Předložená dizertační práce na téma Studium reverzibilní adsorpce nukleových kyselin na pevných nosičích“ se k tomuto směru připojuje a přispívá k jeho rozvoji. Vychází z velmi široké studie současného stavu znalostí na dané téma a shrnuje 112 citovaných prací. Citace jsou logicky postupně, jak jsou citovány, seřazeny a jsou uváděny normovaným způsobem. Přehled současného stavu znalostí, který je teoretickým základem práce, jasně nejprve vysvětluje základní pojmy a postupně předkládá znalosti na témata magnetické nosiče, separace nukleových kyselin, a amplifikace DNA. V kapitole Cíl práce jsou presentovány hlavní cíle práce, které odpovídají zadání dizertační práce. V dizertační práci se autorka zabývala problematikou izolace DNA z komplexních vzorků obsahujících PCR inhibitory (různé druhy potravin a další biologické materiály) s využitím různých polymerních magnetických neporézních nosičů P(HEMA-co-GMA), P(HEMA-co-GMA), PGMA funkcionalizovaných karboxylovými skupinami, nanonosičů manganatého peroskvitu La0.75Sr0.25MnO3 pokrytých vrstvou silikagelu a termosenzitivních poly(N- isopropylakrylamidových) mikronosičů - P(NIPAAm) pro izolaci DNA. Optimalizovala podmínky sorpce i eluce a vyhledala nejlepší nosič. Presentuje, že výhodou magnetické separace produktu je především její jednoduchost a rychlost i možnost opakovaného používání. Experimentální část i výsledky a diskuze jsou sepsány pečlivě a vybrané výsledky jsou vhodně tabelovány. Diskuse je dobře vedená a jednotlivé dílčí výsledky jsou dobře presentovány a možná by si zasloužily zdůraznění např. grafickým zvýrazněním na konci každé kapitoly a podkapitoly. Bylo by možná také užitečné k takovým závěrům uvézt příklad praktického využití, nebo praktickému využití a výhodám navrhovaných postupů věnovat odstavec v diskusi či závěru. Závěry práce jsou správně vyvozeny a vhodně stručnou formou presentovány. Opět bych doporučil vhodné grafické zvýraznění. Cíle v práci stanovené, byly splněny. Závěrem: Rozsáhlá studie současného stavu znalostí je velmi dobře utříděná a instruktivní. Experimentální část byla metodicky prováděná a využívala širokou škálu experimentálních technik. Poskytuje řadu zajímavých výsledků, které dokládají zvládnutí a navržení různých experimentálních technik z oboru molekulární biologie v oblasti izolace DNA mikroorganismů z reálných vzorků, především mléčných výrobků, pomocí reverzibilní absorbce nukleových kyselin na pevných, magnetických nosičích. Předložená práce je dokladem dobré výzkumné činnosti uchazečky, schopnosti analyzovat a syntetizovat získané informace. Práce je napsána v přiměřeném rozsahu, srozumitelně a na výborné úrovni. Uchazečka prokázala i schopnosti publikační presentováním odborných článků v národních a zahraničních časopisech s impakt faktorem nebo s recenzním řízením /čtyři a dvě publikace/ a presentováním výsledků na mezinárodních a národních konferencích formou referátů, příspěvků ve sbornících a posterů / celkem 24 sdělení /. Disertační práce dle mého přesvědčení obsahuje původní a neuveřejněné výsledky. Žádné věcné nedostatky jsem neobjevil. Na základě výše uvedeného doporučuji dizertační práci Ing. Štěpánky Trachtové přijmout k obhajobě a dalšímu řízení.
eVSKP id 42187