Posudky závěrečné kvalifikační práce

Posudek vedoucího

Chytil, Martin

Diplomová práce studentky Bc. Aleny Seredy navazuje nejen na její bakalářskou práci a je věnována interakcím hyaluronanu (HA) a hovězího sérového albuminu. Problematika interakcí hyaluronanu a dalších molekul (tenzidy, amfifilní látky) je jednou ze stěžejních, které jsou řešeny na ÚFSCH. Interakce s proteiny pak otvírají další možnosti výzkumu a uplatnění. Práce je poměrně rozsáhlá a to i přesto, že text je zhuštěný, jednotlivé odstavce a také rovnice či obrázky nejsou odsazeny od textu či od sebe. V teoretické části se studentka věnuje hyaluronanu a albuminu nejprve odděleně, poté se věnuje polysacharido-proteinovým komplexům, nechybí ani poměrně detailní popis instrumentálních metod, použitých pro realizaci experimentů. Je zde vidět snaha co nejvíce přiblížit problematiku čtenáři, nicméně domnívám se, že některé pasáže s tématem souvisí jen okrajově a mohly by se vypustit. Experimentální část přináší poměrně hodně výsledků. Jejich grafické zpracování však má několik nedostatků: chybné ohraničení, nesprávné umístění samotných grafů i tabulek v textu (mají být na střed) i legendy, body jsou místy velmi malé, apod. Přesto mají učitou vypovídající hodnotu. Diskuse výsledků je obsáhlá a je nutno podotknout, že místy těžce čtivá, poměrně často se "skáče" z jednoho systému na jiný apod. Obtížná srozumitelnost je způsobena pravděpodobně i z důvodu nesprávného zakončení slov, či chybná nebo chybějící diakritika, které plynou z faktu, že mateřským jazykem studentky není čeština. Nicméně, i přesto by si na správnou gramatiku měla studentka dát větší pozor, přece jen od bakalářské práce uběhly dva roky. Některé vyslovené závěry nejsou podložené přímo nějakým pozorováním, měřením či odkazem na literaturu a studentka má tendence se pouštět do spekulací. Některá tvrzení znějí rovněž protichůdně. Uvádění některých literárních zdrojů není uspořádané a vyskytují se odkazy typu [58,43,59], apod. Konkrétně pak vybírám některé připomínky: - Root mean square radius (singulár!) = radius of gyration (viz. Abstract) - chyby v angličtině (Abstract): nevhodně volená některá slovesa či přídavná jména, chybné předložky či stavba vět. - Při popisu reologických vlastností HA v kapitole 2.1 je třeba upřesnit o jakou molekulovou hmotnost HA se jedná, resp. v jakém rozmezí s pohybuje "nízkomolekulová HA" - V kapitole 2.2.2 věnující se vazbě albuminu a léčivých látek se studentka zmiňuje, že vazba popisované látky na albumin je endotermická u jiné exotermická. Pojem endotermní/exotermní vazba je nesprávný. Endo- či exotermní může být proces, reakce, ale nikoliv vazba. - Nejednotnost v uvádění hodnoty izoelektrického bodu albuminu; na str. 9 je uvedeno pI = 4,7; na straně 15 pI = 4,9. - U popisu měření SEC-MALLS chybí údaj o jaký přístroj, od jakého výrobce se jedná. - V podkapitole měření ITC je jasné, že exo signál bude odpovídat exotermním procesům a endo těm endotemním, nicméně není zde uvedeno, jakým způsobem, software přístroje zobrazuje/orientuje buď endo, nebo exo signály. - V diskusi UV signálu u SEC-MALLS není uvedeno, jakým způsobem se počítalo procentuální zastoupení odfiltrovaného albuminu, resp. chybí zde kalibrační křivka pro albumin v čisté vodě. Studentka navíc předpokládá, že ve vodě se netvoří nerozpustné agregáty, které by rovněž mohly být do jisté míry odstraněny filtrací. V grafu č. 11 nerozumím pojmu "objeveného" množství albuminu. - v grafu č. 14 jsou velmi vysoké hodnoty Z-průměru velikostí částic, které se pohybují řádově až v desítkách mikrometrů. Pokud je mi známo ZetaSizer tohoto typu má limit detekce někde u 5 mikrometrů. Nakolik jsou tyto hodnoty skutečně věrohodné? - seznam použité literatury je opravdu nezvykle rozsáhlý a na diplomovou práci až předimenzovaný. Vypracování řešení práce se studentka zhostila zodpovědně, leč často ne úplně dbala rad či pokynů a v posledním semestru ani příliš nepoužila možnost konzultací. I přes uvedené výtky a připomínky, má předkládaná práce studentky odbornou kvalitu odpovídající DP. Studentka provedla řadu měření a byla schopná pracovat samostatně. Proto doporučuji tuto práci k její obhajobě.

Dílčí hodnocení
Kritérium	Známka	Body	Slovní hodnocení
Splnění požadavků zadání	A
Studium literatury a její zpracování	B
Využití poznatků z literatury	B
Kvalita zpracování výsledků	B
Interpretace výsledků, jejich diskuse	C
Závěry práce a jejich formulace	B
Využívání konzultací při řešení práce	C
Celkový přístup k řešení úkolů	B

Navrhovaná známka: B

Posudek oponenta

Hermannová, Martina

Diplomová práce studentky Bc. Aleny Seredy by se měla věnovat studiu interakcí hyaluronan-hovězí sérový albumin (HA-BSA) s použitím metod rozptylu světla a titrační kalorimetrie. Této problematice je na Ústavu fyzikální a spotřební chemie věnována velká pozornost. Předložená diplomová práce má celkem 88 stran, obsahuje 44 grafů, 2 tabulky a 113 odkazů na publikovanou literaturu. V práci studentka udělala obrovské množství gramatických chyb, které pravděpodobně plynou z faktu, že jejím mateřským jazykem není čeština. Zejména v dnešní době, kdy gramatické chyby opraví nebo alespoň zvýrazní software použitý k sepsání předložené práce, by si studentka měla dát na správnou gramatiku větší pozor. Grafické zpracování celé práce má několik nedostatků, zejména chybné ohraničení a rozmístění grafů i tabulek, uvádění hranatých závorek pro jednotky, použití rozličných druhů písma v textu a v rovnicích a mnoho dalšího. Vzhledem k tomu, že grafy jsou udělány barevně, je možné se v nich orientovat bez sebemenších problémů, i když byly použity velmi malé body. V literární části měla studentka čtenáři přiblížit a sumarizovat doposud známá fakta o interakcích HA-BSA, včetně vlivu teploty a fyziologických podmínek. Teoretická část je poměrně obsáhlá (celkem 32 stran), ale požadovaným tématům je věnována velmi malá pozornost (pouze 5 stran). V této části také chybí, jaké experimentální podmínky jsou pro analýzu BSA a HA používány jinými autory (jaké kolony, průtoky a složení mobilní fáze, koncentrace, …). Tím studentka neměla žádnou představu o tom, zda např. navržené koncentrace analytů mohou poskytnout relevantní výsledky či nikoli. Naproti tomu, detailní popis použitých instrumentálních metod (zejména teorie) souvisí s tématem práce jen okrajově a jsou nadbytečné. Experimentální část je popsána poměrně nesrozumitelně. Interakce HA-BSA byly sledovány v čtyřech prostředích, a to Milli-Q voda, NaNO3, pufr pH 4 a pufr pH 7. V každém ze jmenovaných roztoků je navíc obsažen NaNO3, a to v koncentraci 0,1 mol.dm-3. Interakce ale měly být sledovány při fyziologických podmínkách a ani jeden uvedený roztok těmto podmínkám neodpovídá. Část Výsledky a Diskuze sumarizuje velké množství získaných dat, ale čte se hodně těžko. Některá použitá tvrzení jsou úplně nesprávná, nepodložená žádnými fakty ani odkazy na literaturu. Na škodu také je, že experimenty byly pravděpodobně provedeny jen jednou (úplně chybí chybové úsečky v prezentovaných grafech). Nejhůře jsou provedeny experimenty a diskutovány výsledky SEC-MALS analýz, které jsou nosnou částí diplomové práce. Tu uvádím jen výčet několika z nich.

Dílčí hodnocení
Kritérium	Známka	Body	Slovní hodnocení
Splnění požadavků zadání	D
Logické členění práce	C
Kvalita zpracování výsledků	E
Interpretace výsledků, jejich diskuse	E
Využití literatury a její citace	E
Úroveň jazykového zpracování	C
Formální úroveň práce – celkový dojem	D
Závěry práce a jejich formulace	E

Navrhovaná známka: E

Otázky

1. Již v grafu 1, kde byl analyzován čistý BSA při různé koncentraci bylo změřeno, že v prostředí NaNO3 a vody je Mw zhruba 70-90 kDa (koncentrace BSA do 2 mg.ml-1), ale v prostředí pufrů o pH 4 a 7 pouze 1-20 kDa. Navíc studentka píše, že již samotný BSA v použitém pufru o pH 4 výrazně precipituje. Jaké tedy byly tzv. „Calculated mass“ vzhledem k „Injected mass“ pro různá prostředí? Byly kalibrační závislosti ve všech testovaných prostředích lineární?
2. Graf 2 má bohužel taky téměř nulovou vypovídající hodnotu. O metodě SEC-MALS je známo, že pro získání důvěryhodných výsledků je nutné měřit v určitém rozsahu koncentrací tak, aby daný analyt poskytoval dostatečný signál, ale zároveň nedocházelo k deformaci chromatografických píků. Tato koncentrace je pro polymer s Mw ~70 kDa někde kolem 1 mg.ml-1. kde již byly získány gyrační poloměry odpovídající velikosti BSA (~2-3 nm).
3. Graf 7 a 8. Jak si studentka vysvětluje změření Mw a Rh pro čistý hyaluronan ve vodě a NaNO3 zhruba 450 kDa a 33 nm, ale v prostředí pufrů o pH 7 a pH 4 pouze 150 kDa a 15 nm? Čistý HA je v těchto pufrech rozpustný. Jaké byly tzv. Calculated mass? Podobný dotaz vyplývá i z grafů 22 a 23 pro hyaluronan s vyšší Mw.
4. Graf 10 a Graf 11. Jak se počítal Poměr odfiltrovaného (objeveného) k původnímu množství BSA? Znamená to, že jste sledovala interakce HA-BSA pomocí SEC-MALS tak, že v některých prostředích jste si všechen BSA odfiltrovala? Kolik bylo ve vzorku přítomného HA (myslím po filtraci, ne před ní)?
5. Vzhledem k tomu, že při SEC-MALS analýzách a při použití DLS a titrační kalorimetrie bylo úplně jiné složení roztoků, není možné výsledky z těchto metod nikterak porovnávat.